李曉峰，張文瑛，梁鐵生

老年癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)是一種起病隱匿、呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響其工作及生活，同時給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。近年，我國人口老齡化日益嚴(yán)重，AD患病率明顯升高，成為繼心血管病、癌癥及腦卒中之后威脅我國國民生命健康的又一“殺手”，引起全社會關(guān)注[2]。但到目前為止，臨床上仍缺乏AD早期診斷和治療的有效手段。近年，隨高通量技術(shù)的不斷完善，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)作用及功能逐漸被探究出來，成為生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一[3]。越來越多研究表明，lncRNA與AD、帕金森病及亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4，5]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者腦組織中異常表達(dá)[6]。但其在外周血的表達(dá)情況及對AD患者的價值目前探究較少。本研究選取2016年1月～2018年12月于本院收治的97例老年癡呆患者和100例非老年癡呆健康體檢者作為研究對象，探討LncRNA-BC200和LncRNA-17A在老年癡呆患者外周血中的表達(dá)情況及臨床價值。

1 資料和方法

1.1 研究對象 入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國國立神經(jīng)病、語言障礙和卒中研究所-阿爾茨海默病及相關(guān)疾病協(xié)會的“很可能AD”診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥65歲；(3)簡易精神狀態(tài)量表(mini-mental state examination，MMSE)評分低于最低臨界值；(4)Hachinski缺血指數(shù)量表≤4分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并抑郁癥或病史；(2)既往有嚴(yán)重心、肝、腦、腎等內(nèi)科疾病；(3)合并癌癥。遵循以上標(biāo)準(zhǔn)，共納入97例AD患者，其中男49例，女48例；年齡65～80歲，平均(71.32±6.55)歲。選取同期于本院進(jìn)行體檢的性別及年齡與之相匹配的100例健康體檢者作為對照組。所有患者及家屬均簽署知情同意書，并通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A檢測 (1)標(biāo)本收集：抽取兩組患者入組后1 d空腹靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，4000 r/min離心10 min分離血清，并用2個新的EP管進(jìn)行分裝(用于LncRNA-BC200和LncRNA-17A檢測)，于-80℃冰箱保存。(2)總RNA提?。喝〕鯡P管解凍，并向其中加Trizol試劑，顛倒混勻，后再向其中加入氯仿，劇烈震蕩，離心取上層無色液體至新EP管，加入異丙醇，混勻，離心棄上清，后加入焦碳酸二乙酯使其溶解。(3)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA：參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系(10 μl)：1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶混合液、1 μl Oligo Dt Primer、5 μl總RNA和3 μl雙蒸餾水，在PCR儀上進(jìn)行變性及退火(37 ℃ 15 min～80 ℃ 10 s)；將制備的cDNA用DEPC液稀釋后保存。(4)實時熒光定量PCR：參考熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系(25 μl)：上下游引物各1.0 μl、SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μl、cDNA 0.5 μl和雙蒸餾水10 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性、35個循環(huán)(95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30s退火、72 ℃ 30 s延伸)，后繪制熔解曲線分析PCR產(chǎn)物特異性；每孔設(shè)置3個復(fù)孔，取3孔CT平均值作為最后的CT值，以2-△△Ct表示相對表達(dá)水平其中以GAPDH為內(nèi)參基因，LncRNA-BC200上下游引物分別為：5’-CTCAGGGAGGCTAAGAGGCG-3’和5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；LncRNA-17A上下游引物分別為：5’-CCACCCTGAACTGACACAT-3’和5’-GCAAAGGTGCTAATCTTGACTCTTG-3’。

1.2.2 AD患者認(rèn)知功能評判標(biāo)準(zhǔn) 本研究采用MMSE評判AD患者認(rèn)知功能，具體包括20個題目，涉及即刻記憶、常識、記憶、地點定向等，得分越低則提示認(rèn)知功能越差。其中患者教育程度不同其判定為AD的MMSE評分不同：文盲≤17分，小學(xué)程度≤ 20分，中學(xué)程度(含中專)≤ 22分，大學(xué)程度(含大專)≤ 23分。AD嚴(yán)重程度分級：輕度認(rèn)知功能障礙MMSE≥21分，中度認(rèn)知功能障礙MMSE 10～20分，重度認(rèn)知功能障礙MMSE≤ 9分。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平比較 與對照組比較，AD組外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD的診斷價值 繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)(見圖1)，LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD均有一定診斷價值，兩者聯(lián)合可明顯提高診斷效能(見表2)。

2.3 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分均呈正相關(guān)(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.725和0.684。

2.4 外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與AD嚴(yán)重程度的關(guān)系 97例AD患者中，輕度認(rèn)知功能障礙患者42例，中度認(rèn)知功能障礙患者31例，重度認(rèn)知功能障礙患者24例；外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A在重度、中度和低度認(rèn)知功能障礙患者中依次下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

組別例數(shù)LncRNA-BC200LncRNA-17AAD組對照組tP971001.89±0.421.15±0.3413.61101.56±0.351.07±0.2211.8020

表2外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A對AD的診斷價值分析

指標(biāo)AUC95%CIP敏感度(%)特異度(%)LncRNA-BC200LncRNA-17ALncRNA-BC200+LncRNA-17A0.7510.7040.8950.723～0.7890.682～0.8370.823～0.9340.0280.042068.4962.4585.8270.1165.2388.83

圖1 LncRNA-BC200和LncRNA-17A診斷AD的ROC曲線圖

3 討 論

到目前為止，國內(nèi)外缺乏診斷AD的早期敏感指標(biāo)，有文獻(xiàn)報道，全球AD患者中僅1/3患者獲得早期診斷及干預(yù)，大部分患者確診時已處于AD晚期，給患者生活帶來極大傷害[7]。因此尋找敏感、有效、方便且經(jīng)濟(jì)的診斷方法已迫在眉睫。LncRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而成，是一種長度超過200個核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的核酸分子，從而被認(rèn)為是“垃圾”分子[8]。近年，隨分子技術(shù)的不斷發(fā)展，LncRNA作用及生物學(xué)功能逐漸被挖掘，認(rèn)為與劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動密切相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可廣泛存在于人類血液、體液及組織中，且血漿LncRNA在經(jīng)過反復(fù)凍融后仍可保持穩(wěn)定，而外周血標(biāo)本獲取便捷、經(jīng)濟(jì)，促進(jìn)了血液LncRNA研究的快速發(fā)展[10，11]。近年來，越來越多表觀遺傳學(xué)研究表明，lncRNA可參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展，當(dāng)其表達(dá)或功能異常，可直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[12]。

LncRNA-BC200可在人類神經(jīng)細(xì)胞中特異性表達(dá)，主要通過特定調(diào)節(jié)機(jī)制參與神經(jīng)元細(xì)胞突觸小體的形成，在一般正常組織中均為較低表達(dá)；但近年有研究發(fā)現(xiàn)，其在AD患者海馬組織中顯著高表達(dá)，且與臨床癥狀等密切相關(guān)，提示LncRNA-BC200對AD具有一定價值[13]。但尚未涉及其在AD患者外周血中的研究。在本研究中，AD組外周血LncRNA-BC200水平明顯高于對照組，從外周血水平發(fā)現(xiàn)了價值，后來通過繪制ROC曲線圖發(fā)現(xiàn)外周血LncRNA-BC200可幫助診斷AD，這與王瑤等[14]部分研究結(jié)果基本一致，再次突出了外周血LncRNA-BC200檢測對AD的價值。LncRNA-17A是近年Massone等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)的一種與AD相關(guān)的新LncRNA，在AD患者腦組織中高表達(dá)，主要通過介導(dǎo)GABA信號通路及Aβ 產(chǎn)生參與AD發(fā)生發(fā)展。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)LncRNA-17A通過調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞系的自噬和凋亡構(gòu)建AD模型，從細(xì)胞水平探討了其價值，但始終未涉及其臨床相關(guān)研究。而本研究發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血LncRNA-17A水平明顯高于正常體檢者，后通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)其在診斷AD上具有一定價值，從臨床外周血水平初步探討了LncRNA-17A對AD患者的價值。而研究還發(fā)現(xiàn)與單項指標(biāo)比較，LncRNA-BC200和LncRNA-17A聯(lián)合可明顯提高其診斷效能，為AD患者診療作出了一定的貢獻(xiàn)。認(rèn)知功能障礙是AD患者主要特征之一，準(zhǔn)確判斷認(rèn)知功能障礙及嚴(yán)重程度對AD患者十分重要，但目前臨床多以MMSE等作為其判斷標(biāo)準(zhǔn)，是一種主觀性評價方案，在一定程度上缺乏客觀性[17]。本研究通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A與MMSE評分均呈明顯正相關(guān)，且在重度、中度和低度認(rèn)知功能障礙患者中依次下降，提示AD患者外周血LncRNA-BC200和LncRNA-17A水平越高，其認(rèn)知功能障礙越嚴(yán)重，有望成為AD患者認(rèn)知功能障礙評價的客觀性指標(biāo)。

綜上認(rèn)為，LncRNA-BC200和LncRNA-17A在AD患者外周血中異常高表達(dá)，與認(rèn)知功能密切相關(guān)，兩者聯(lián)合可幫助診斷AD，為AD患者診療提供更多可能。后續(xù)可通過擴(kuò)大樣本量和收集范圍進(jìn)行大樣本多中心研究，提高本文結(jié)果可信度，為其推廣貢獻(xiàn)一份力量。