趙光軍 朱海 佟延南

摘要? ? 該研究從不同的羅非魚養(yǎng)殖區(qū)域、養(yǎng)殖模式、養(yǎng)殖環(huán)境中分別采集樣品，經(jīng)前期處理后得到262株待測菌株。以無乳鏈球菌為指示菌株，利用瓊脂擴散法篩選拮抗菌。通過安全性試驗對初篩菌株進行復篩，同時進行16S rDNA分子鑒定。結果顯示，初篩得到29株拮抗菌，其中6株對無乳鏈球菌安全，分屬于芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬3個屬。

關鍵詞? ? 羅非魚;養(yǎng)殖環(huán)境;益生菌;篩選

中圖分類號? ? S917.1? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）14-0210-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? The study collected samples from different tilapia culture areas，culture models and culture environments，and obtained 262 strains after pretreatment.Streptococcus agalactiae was used as an indicator strain to screen antagonistic strain by agar diffusion method.The primarily screened strain was rescreened through a safety test，and the 16S rDNA sequence molecule was simultaneously identified.The results showed that，among 29 primarily screened strains of antagonistic bacteria，6 strains were safe to Streptococcus agalactiae，belonging to the genus Bacillus，Pseudomonas，and Enterobacter.

Key words? ? tilapia;culture environment;probiotics;screening

羅非魚（Tilapia）自1976年被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為優(yōu)良養(yǎng)殖品種進行推廣以來，現(xiàn)已成為世界性的養(yǎng)殖魚類[1]。中國的羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在世界上占有舉足輕重的地位，養(yǎng)殖產(chǎn)量在2017年達到了158.47萬t，占全部淡水養(yǎng)殖魚類的6.14%，是除四大家魚和鯉魚、鯽魚外唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超100萬t的淡水養(yǎng)殖魚類[2]。中國早已成為世界最大的羅非魚生產(chǎn)國和出口國，且南方的羅非魚是我國非常重要的養(yǎng)殖品種[3-4]。近幾年的鏈球菌病爆發(fā)，導致羅非魚的產(chǎn)量下降，加之養(yǎng)殖環(huán)境惡化，磺胺類、喹諾酮類抗生素等藥物的濫用，致使羅非魚的出口受限，給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了重創(chuàng)[5]。通過環(huán)境友好的方式進行鏈球菌病防控可改善現(xiàn)有狀況，為羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到一定的推動作用。國際益生菌和益生元科學協(xié)會將益生菌定義為當達到足夠劑量時能夠給宿主帶來有益影響的活體微生物[6]，通過此定義可知，具有改良水質效果、改善水產(chǎn)動物胃腸道、拮抗病原菌等的菌株均可歸屬為益生菌。利用益生菌進行生物防治，可減少抗生素的使用，避免出現(xiàn)耐藥性，達到生態(tài)養(yǎng)殖的效果。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

該研究以無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）為拮抗菌篩選的指示菌株，該菌株于2016年從海南瓊海某養(yǎng)殖場A的患病羅非魚中分離獲取，且經(jīng)過分子鑒定，編號QHTY-3。試驗所用羅非魚由海南瓊海某養(yǎng)殖場B提供，選用羅非魚體重200 g左右、規(guī)格整齊、體格健壯、體表無損傷。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH值為7.2～7.4;固體培養(yǎng)基為1 000 mL加20 g瓊脂;半固體培養(yǎng)基為1 000 mL加10 g瓊脂。腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試驗用試劑耗材均由海南諾琪蘭科技有限公司購置。

1.2? ? 樣品的采集與前期處理

1.2.1? ? 樣品采集。于2017年5月至2018年5月在海南的羅非魚主養(yǎng)區(qū)?？?、文昌、瓊海等地采集不同水體環(huán)境中的水樣與泥樣，于4 ℃條件下帶回實驗室處理。

1.2.2? ? 水樣處理方法。用無菌去離子水對水樣進行10倍梯度稀釋，取0.1 mL合適濃度的稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)1～5 d，連續(xù)觀察菌落生長情況。挑取菌落形態(tài)不同的菌株進行純化后保種，用作待測菌株。

1.2.3? ? 泥樣處理方法。取5 g泥樣加5 mL無菌生理鹽水，于4 ℃條件下振蕩30 min（條件不允許時在渦旋混合器上以最大速度混合10 min），4 ℃靜置30 min，取上層液體4 ℃，1 000 r/m離心30 min，取上清液，以生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取0.1 mL合適的濃度的稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)2～5 d，連續(xù)觀察菌落生長情況。挑取菌落形態(tài)不同的菌株進行純化后保種，用作待測菌株。

1.3? ? 拮抗菌的篩選

用BHI活化無乳鏈球菌，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化待測菌株。制作雙層平板，下層為固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，上層為混有無乳鏈球菌的半固體BHI（50 ℃左右時在BHI中加入活化的無乳鏈球菌，混勻）。以6 mm孔徑打孔器在雙層平板上打孔，每孔加入50 μL待測菌株，以等量生理鹽水作為對照，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，測量抑菌圈大小。選取抑菌效果較好的菌株用于后續(xù)研究。

1.4? ? 安全性試驗

選取體長為20 cm左右，體重約200 g的健康羅非魚在實驗室暫養(yǎng)7 d后進行分組，每組10尾，飼養(yǎng)在約150 cm×100 cm×50 cm規(guī)格的水族箱中（或網(wǎng)箱中）。將待測菌株接種于普通淡水液體培養(yǎng)基中，37 ℃擴大培養(yǎng)18 h，用滅菌的生理鹽水洗菌2次，濃度調至1×108 CFU/mL，按菌液與羅非魚體重1∶1 000的質量比進行腹腔注射，對照組每尾注射等量的無菌生理鹽水，每株菌設置2個平行組進行試驗。每天正常投喂人工配合飼料，連續(xù)觀察15 d，并每天記錄實驗用魚的死亡情況。

1.5? ? 16S rDNA分子鑒定

利用通用引物擴增出前期研究篩選菌株的16S rDNA序列并委托技術公司進行測序，將測定的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，初步得到待檢菌株的分子鑒定信息。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 樣品的采集和前期處理

采集到的樣品經(jīng)前期處理后，初步獲取不同生長形態(tài)的單菌落262株，詳細結果見圖1和表1。

2.2? ? 拮抗菌的篩選

經(jīng)雙層培養(yǎng)基的培養(yǎng)初篩后，得到29株對無乳鏈球菌具有較強拮抗作用的菌株，抑菌圈直徑為12.98 mm，結果見圖2和表2。

2.3? ? 安全性試驗

試驗羅非魚注射待測菌株后，經(jīng)15 d的連續(xù)飼養(yǎng)，死亡情況見表3。其中，有6株待測菌株的致死率為0，即對羅非魚安全。

2.4? ? 16S rDNA分子鑒定

將29株待測菌株的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，結果見表4。

3? ? 結論與討論

本次試驗共采集了4個養(yǎng)殖場、3種養(yǎng)殖模式的樣品，通過分析池塘的養(yǎng)殖模式可知，泥樣中微生物種類較水樣中更為豐富;養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)多樣性越復雜，微生物種類越豐富。林國榮等[7]利用Illumina高通量測序技術對不同養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖池塘水體和底泥中的菌群結構進行檢測，結果表明，不同養(yǎng)殖模式下池塘的水體和底泥之間、同一養(yǎng)殖池塘的水體和底泥之間，微生物的區(qū)系組成存在著一定差異;微生物的多樣性和豐富度也表現(xiàn)出了很大的差異，底泥的微生物多樣性明顯高于水體，與本研究的結果相符。微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境生物多樣性中占有重要的位置，并發(fā)揮著極其重要的作用，對養(yǎng)殖水體調控、養(yǎng)殖對象菌群結構穩(wěn)定、養(yǎng)殖環(huán)境物質循環(huán)和能量流動等都有較大影響[8]。養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的多樣性受到養(yǎng)殖模式、養(yǎng)殖品種影響的同時，也存在著一定的季節(jié)性差異[9-10]，對于羅非魚養(yǎng)殖環(huán)境及腸道的微生物多樣性，已有學者做過相關研究，結果顯示，不同養(yǎng)殖區(qū)域、不同養(yǎng)殖階段、不同養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖環(huán)境下羅非魚的腸道菌群均存在顯著差異[11]，微生物多樣性受養(yǎng)殖環(huán)境的影響，同時，微生物也可通過調節(jié)水質、增強免疫力、提供餌料利用率等方面改善養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖生物的現(xiàn)狀。因此，可通過加強對養(yǎng)殖環(huán)境微生物的研究對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境調控進行科學指導。

待測菌株經(jīng)20 h的體外拮抗試驗后，有29株對對無乳鏈球菌具有較強拮抗作用，抑菌圈直徑為（12.98±8.60）mm，各菌株的抑菌效果差異較大，其中WCDZP-22、QHTY-84、QHTY-93等菌株的拮抗效果最好，抑菌圈超過20 mm。國內對于水產(chǎn)養(yǎng)殖對象病原菌的拮抗菌篩選，已有超過15年的時間，并取得了一定成效，主要針對的病原菌有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、飄浮弧菌（Vibrio natriegen）和沙蠶弧菌（Vibrio nereis）等病原性弧菌[12-13]及嗜水氣單胞菌[14]、水霉（Saprolegnia）[15]、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）[16]等。近年也有學者對羅非魚源無乳鏈球菌的拮抗菌進行了研究，結果表明，該類拮抗菌廣泛存在與羅非魚的養(yǎng)殖環(huán)境及其腸道內，較易分離得到，但生產(chǎn)應用尚需進一步研究[17-18]。

初篩菌株的安全性試驗與16S rDNA分子鑒定結果顯示，有QHTM-62、HKSJ-2、QHTY-61等6株菌對羅非魚無致病性，該6株菌分屬于芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬等3個屬，其中有4株均為芽胞桿菌，說明無乳鏈球菌對芽胞桿菌屬的細菌表現(xiàn)較為敏感，這與何濤等人的研究結果一致[19-21]。在后續(xù)拮抗菌篩選可縮小研究范圍，專門針對芽孢桿菌進行篩選，這將大幅度減少工作量。

針對拮抗菌的作用機理與生產(chǎn)應用的研究相對匱乏，后續(xù)的研究工作方向重點偏向機理與應用，這將為今后有益微生物制劑的研發(fā)、應用及水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供科學依據(jù)。

4? ? 參考文獻

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