楊仁俊，汪 婧，孫 頡，張 娜，孔德潤

膽汁淤積性肝病在人群及臨床中非常常見，它可由各種原因引起的膽汁生成、分泌和排泄障礙，導(dǎo)致膽汁在肝內(nèi)淤積，而引起的肝細(xì)胞、肝內(nèi)外膽管一系列器質(zhì)性損害和功能性異常的肝膽系統(tǒng)疾病[1-2]。此病預(yù)后較差，無令人滿意的治療方案。Pescadillo 同源蛋白1 (Pescadillo homologue 1,Pes1)最初在斑馬魚的胚胎中被發(fā)現(xiàn)，與增殖阻斷蛋白1(block of proliferation 1,BOP1)和WD重復(fù)蛋白12(WD repeat domain 12,WDR12)結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，對(duì)于核糖體60 S亞基的合成至關(guān)重要[3]。Pes1是一種核仁蛋白，在鼠或人的正常胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。Pes1在其基序中含有保守的乳腺癌易感基因末端結(jié)構(gòu)域，考慮到此結(jié)構(gòu)域作為響應(yīng)DNA損傷反應(yīng)的整合信號(hào)模塊，Pes1也可能參與DNA損傷和修復(fù)[4]。糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是已知在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶[5]。該研究以膽汁淤積性肝病小鼠為模型，研究Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路中的蛋白在膽汁淤積性肝病小鼠中的表達(dá)，旨在更好地了解Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路在膽汁淤積性肝病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑20只6～7周齡的SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠購自南京模式動(dòng)物研究所?？偰懼?total bile acid，TBA)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)測(cè)試盒均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)專用試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司；多聚甲醛固定液、RIPA裂解液以及特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Western blot一抗Pes1、β-actin、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、磷酸化Akt絲氨酸473位點(diǎn)(phospho-Akt ser473，p-Akt473)、磷酸化Akt蘇氨酸308位點(diǎn)(phospho-Akt thr308，p-Akt308)、GSK-3β、p-GSK-3β均購自美國abcam公司；Western blot二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物造模與處理所有小鼠在安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心飲食飲水，溫度控制在20～26 ℃，濕度控制在50%左右，12 h光照周期單籠喂養(yǎng)。所有小鼠適應(yīng)環(huán)境，正常飲食飲水1周后，隨機(jī)分組，每組10只。對(duì)照組C57BL/6喂食普通基礎(chǔ)飼料4周，實(shí)驗(yàn)組C57BL/6喂養(yǎng)含有0.1% 3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫-2,4,6-三甲基吡啶(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine，DDC) 飼料4周。在實(shí)驗(yàn)麻醉之前先稱量每只小鼠體質(zhì)量，之后均先按小鼠每0.1 ml/10 g體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，之后心臟取血獲取血清，-80 ℃下保存；取肝臟用冰PBS清洗后立即在液氮中急速冷卻，置-80 ℃儲(chǔ)存。

1.3 方法

1.3.1肝臟病理學(xué)觀察 取小鼠肝臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，做常規(guī)病理HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.3.2小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 取小鼠血清，按照生化試劑測(cè)試盒說明書操作檢測(cè)血清TBA、TBIL、AKP、GGT水平。

1.3.3Western blot 用RIPA裂解液補(bǔ)充1%蛋白酶抑制劑和2%磷酸酶抑制劑的總混合物在冰上操作提取肝組織總蛋白。各蛋白樣品通過BCA試劑盒測(cè)定濃度并用RIPA配制成相同濃度，將每組蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液充分混合后，將其在100 ℃金屬浴下煮沸10 min，使蛋白變性并在SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，并以恒流200 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%BSA封閉液封閉1～1.5 h。之后的膜與Pes1、β-actin、PI3K、p-PI3K、AKT、p-Akt473、p-Akt308、 GSK-3β、p-GSK-3β等一抗4 ℃孵育過夜，用TBST清洗3次，每次10 min，在室溫下與二抗(1 ∶5 000)孵育1～1.5 h，再次用TBST清洗后顯影，應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像儀曝光顯影采集圖像。

1.3.4RT-PCR 使用TRIzol試劑提取肝組織的總RNA，然后測(cè)RNA濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析計(jì)算mRNA表達(dá)量。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Pes1正向引物：5＇-CCCAGTGGGTCTTTGACTGT-3＇，反向引物：5＇-ACGAAGGGTGAAAGATGTGG-3＇；β-actin正向引物：5＇-CTCTCCCTCACGCCATC-3＇，反向引物：5＇-ACGCACGATTTCCCTCTC-3＇。

2 結(jié)果

2.1 膽汁淤積性小鼠及正常小鼠體質(zhì)量檢測(cè)在喂養(yǎng)的4周內(nèi)，DDC模型小鼠隨著喂食時(shí)間增加出現(xiàn)呆滯少動(dòng)，皮膚黃染；對(duì)照組小鼠情況基本正常。解剖后DDC模型小鼠有腹膜黃染，肝臟色稍黃，質(zhì)稍硬；正常組小鼠肝臟呈粉紅色、光滑柔軟。開始喂養(yǎng)時(shí)正常對(duì)照組小鼠體質(zhì)量為(24.32±0.19)g，與DDC組小鼠體質(zhì)量(24.19±0.46)基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喂養(yǎng)4周后DDC小鼠體質(zhì)量為(18.32±1.13)g，與對(duì)照組正常C57BL/6小鼠(25.30±0.94)g比較，DDC模型小鼠體質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.83，P<0.05)。見圖1。

圖1 4周后小鼠體質(zhì)量變化1：對(duì)照組；2：DDC實(shí)驗(yàn)組;與對(duì)照組比較： *P<0.05

2.2 小鼠肝組織病理學(xué)觀察肝臟常規(guī)病理HE染色光學(xué)顯微鏡下顯示，對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，膽管周圍基本無炎性細(xì)胞，而DDC模型小鼠肝組織中可見匯管區(qū)擴(kuò)大，匯管區(qū)以及膽管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，膽管變形以及膽管增生。見圖2。

圖2 小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn) HE×200A：對(duì)照組；B：DDC實(shí)驗(yàn)組

2.3 小鼠血清生化指標(biāo)水平與對(duì)照組C57BL/6比較，膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBA水平明顯增加(t=18.46，P<0.01)，見圖3A；膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBIL水平明顯增加(t=9.64，P<0.01)，見圖3B；膽汁淤積性肝病小鼠血清中AKP活力明顯增加(t=4.88，P<0.01)，見圖3C；膽汁淤積性肝病小鼠血清中GGT水平明顯增加(t=6.79，P<0.01)，見圖3D。

圖3 小鼠血清生化指標(biāo)的水平

A：TBA；B：TBIL；C：AKP活力；D：GGT；1：對(duì)照組；2：DDC實(shí)驗(yàn)組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.4 膽汁淤積性小鼠以及正常小鼠肝臟中Pes1的表達(dá)水平Western blot和RT-PCR檢測(cè)膽汁淤積性小鼠以及正常小鼠肝臟中Pes1蛋白以及mRNA的表達(dá)。GraphPad Prism 6.02分析顯示，膽汁淤積性小鼠肝臟中Pes1蛋白(t=11.85，P<0.01)及mRNA(t=5.33，P<0.01)的表達(dá)水平均低于正常小鼠肝臟組織，兩者結(jié)果是一致的。見圖4。

2.5 膽汁淤積性小鼠中PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的水平Western blot法檢測(cè)小鼠肝臟中PI3K/AKT/GSK-3β蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組比較，膽汁淤積性肝病小鼠即DDC模型小鼠肝臟中總的PI3K蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而p-PI3K呈低表達(dá)，與對(duì)照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.23，P<0.01)，見圖5A；兩組小鼠肝臟中總的AKT蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而DDC小鼠肝臟中p-Akt473、p-Akt308呈低表達(dá)，與對(duì)照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.62、8.62，P<0.05)，見圖5B；兩組小鼠肝臟中總的GSK-3β蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而DDC小鼠肝臟中p-GSK-3β也是呈低表達(dá)，與對(duì)照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.10，P<0.05)，見圖5C。

圖4 小鼠肝臟中 Pes1 蛋白和mRNA的表達(dá)水平

A：Pes1在肝臟中蛋白的表達(dá)；B:Pes1在肝臟中mRNA的表達(dá)；1：對(duì)照組；2：DDC實(shí)驗(yàn)組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

膽汁淤積性肝病如常見的原發(fā)性硬化性膽管炎好發(fā)于青壯年男性，起病較隱匿，以進(jìn)行性肝內(nèi)和肝外纖維閉塞性膽管炎為特征，引起肝內(nèi)大膽管節(jié)段性狹窄，膽管閉塞，最終可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[6]。而小鼠DDC喂養(yǎng)是膽汁淤積性肝病的一種成熟模型，本研究中的DDC小鼠模型就是以肝內(nèi)大膽管損傷為主要特點(diǎn)的原發(fā)性硬化性膽管炎的動(dòng)物模型，隨著造模時(shí)間的延長，出現(xiàn)膽管損傷、節(jié)段性膽管狹窄梗阻，長期持續(xù)性的膽汁淤積將進(jìn)展為肝纖維化甚至肝硬化[7]。因此，上述模型是研究膽汁淤積肝病的發(fā)病機(jī)制和尋找治療藥物研究的理想模型。本研究旨在探討Pes1以及PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路在膽汁淤積性肝病中的表達(dá)和作用，有助于將Pes1開發(fā)為膽汁淤積性肝病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Pes1不僅參與核糖體生物發(fā)生即制造核糖體的過程，對(duì)細(xì)胞生長、增殖和動(dòng)物正常發(fā)育至關(guān)重要[3]， Pes1還參與調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)。有研究[8-9]表明，Pes1可直接結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，是一種多功能蛋白質(zhì)，除了胚胎發(fā)育外，還有助于多種生理過程。此外，Pes1的沉默表達(dá)可以使AKT /GSK-3β信號(hào)通路失活[10]。同時(shí)，研究[11-12]表明，PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞中是廣泛存在的，通過調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞代謝、生長、凋亡及分化等過程，抑制細(xì)胞凋亡，而且可保護(hù)肝細(xì)胞免受膽汁酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。GSK-3β是一種多功能激酶，不僅在糖原代謝中起作用，還參與細(xì)胞凋亡，且已知它是細(xì)胞程序性死亡的上游調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn) Caspase-3活化，活化的Caspase-3參與許多監(jiān)管程序，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者；GSK-3β還會(huì)導(dǎo)致線粒體中細(xì)胞色素 C 釋放，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；罨腁KT通過磷酸化GSK-3β上的殘基絲氨酸-9，而抑制其生物活性，即磷酸化 GSK-3β(p-GSK-3β)是非活性的狀態(tài)，從而抑制了Caspase-3 的活化以及細(xì)胞色素C 的釋放，抑制肝細(xì)胞的凋亡，并減少細(xì)胞損傷[13-14]。

圖5 兩組小鼠中PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的變化

A：肝臟中PI3K、 p-PI3K的表達(dá)； B：肝臟中AKT及其磷酸化蛋白的表達(dá)； C：肝臟中GSK-3β、p-GSK-3β的表達(dá)；1：對(duì)照組；2：DDC實(shí)驗(yàn)組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于長期食用DDC,導(dǎo)致小鼠膽汁淤積性肝病的發(fā)生，膽汁淤積，在排泄過程中出現(xiàn)異常，致膽汁淤積性肝病小鼠血清中TBA等生化指標(biāo)水平較對(duì)照組明顯增加。另外，在此研究中首次證明,與對(duì)照組小鼠比較，Pes1在膽汁淤積性肝病小鼠即DDC實(shí)驗(yàn)組中mRNA和蛋白均下調(diào)。同時(shí)，在膽汁淤積性肝病小鼠中p-PI3K、p-Akt473、p-Akt308、p-GSK-3β蛋白較對(duì)照組表達(dá)水平降低，而總的PI3K、 AKT、GSK-3β無明顯變化。結(jié)果表明在膽汁淤積性肝病中由于Pes1表達(dá)水平降低，其機(jī)制是降低的Pes1使 PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路失活，由此依次降低PI3K和 AKT的磷酸化水平，最終下調(diào)了磷酸化GSK-3β的表達(dá)，使磷酸化GSK-3β對(duì)肝細(xì)胞凋亡的抑制、減輕細(xì)胞損傷的作用減弱，從而進(jìn)一步加重了膽汁淤積性肝病的發(fā)生發(fā)展，提示Pes1可能是對(duì)膽汁淤積性肝病起到保護(hù)的作用，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解和治療膽汁淤積性肝病提供了新的見解。但是在細(xì)胞中和組織中增強(qiáng)Pes1的表達(dá)，并通過經(jīng)典的PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路，使之起到對(duì)膽汁淤積性肝病的保護(hù)作用并改善治療膽汁淤積性肝病有待進(jìn)一步的研究。