張 雁, 韓毛振, 羅學(xué)才, 王晶晶 , 周明輝, 陳亞軍

(1. 合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 合肥 231601; 2. 華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 武漢 430074;3. 合肥停弦渡科技有限公司, 合肥 231601)

近年來，微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物的生產(chǎn)中越來越受到重視[1]。雄烯二酮(Androstene)又稱AD，是甾體藥物生產(chǎn)中重要的中間產(chǎn)物，其甾體母核的羥基化可以大大提高藥物活性[2]。雄烯二酮常見的羥基化反應(yīng)有C9位羥基化[3]和C11位羥基化[4]。其中C9位羥基化產(chǎn)物(9-羥基雄烯二酮)在臨床上常用作激素與避孕功能藥物使用，同時也是大量甾體藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，其下游產(chǎn)物包括氫化可的松、地塞米松、黃體酮等，具有重要的商業(yè)價值。9-羥基雄烯二酮的生產(chǎn)主要使用雄烯二酮為原料進行化學(xué)合成，過程繁瑣、成本較高，污染嚴重。而目前發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌屬與紅球菌屬的部分菌株，其3-甾酮-9α-羥基化酶雖然可以催化雄烯二酮的9位羥基化，但其生物催化過程依然存在菌體有害產(chǎn)物分離、副產(chǎn)品對環(huán)境污染、生產(chǎn)效率低而造成生產(chǎn)成本高等問題[5]。

細胞色素P450蛋白(cytochrome P450 proteins/CYP)是一類以亞鐵血紅素輔因子(heme cofactor)為輔基的超大家族，在各種物種中廣泛存在[6]。CYP催化的生物羥化在內(nèi)源性和外源性分子代謝過程中具有重要的作用[7-10]。CYP105是鏈霉菌中廣泛存在CYP基因家族的重要成員，目前報道的鏈霉菌全基因組數(shù)據(jù)中均有發(fā)現(xiàn)[11]。CYP105家族基因除了在菌體代謝中的原生功能外，通常存在很寬的底物作用域，表現(xiàn)催化一些對菌體生長無影響的生物轉(zhuǎn)化類型，例如對外源性物質(zhì)的高效降解[12-13]。維吉尼亞鏈霉菌(Streptomycesvirginiae)IBL14可以多種甾醇類化合物作為唯一碳源，其次級代謝產(chǎn)生了多種新穎的甾醇類化合物[14-15]。本人在對其催化甾體生物轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，基因svu005編碼的細胞色素氧化酶CYP105D1可以雄烯二酮為底物，生物催化形成新的化合物。本研究將來自S.virginiaeIBL14的CYP105D1重組蛋白在大腸桿菌中進行自誘導(dǎo)表達，以提高CYP蛋白的活性表達，并對其生物轉(zhuǎn)化雄烯二酮的功能進行驗證研究。該催化反應(yīng)國內(nèi)外均未見報道，是雄烯二酮微生物轉(zhuǎn)化合成9-羥基雄烯二酮的新途徑，可以有效減少合成步驟、降低生產(chǎn)成本。與分枝桿菌屬與紅球菌屬的3-甾酮-9α-羥基化酶催化工藝相比，無菌體有害產(chǎn)物。同時由于CYP蛋白催化的羥化反應(yīng)具有高度的專一性，可有效減少催化反應(yīng)副產(chǎn)品，在簡化產(chǎn)物純化工藝、防止生產(chǎn)造成的環(huán)境污染方面具有極高的應(yīng)用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

S.virginiaeIBL14(CCTCCM 206045)為擴增CYP105D1蛋白編碼基因svu005提供模板，質(zhì)粒pET28a為目的基因的載體，大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)為表達菌株，由安徽大學(xué)生物集成化實驗室提供。

一步法制備大腸桿菌感受態(tài)(SSCS)試劑盒(上海捷瑞)；DNA凝膠回收試劑盒(上海生工)；限制性內(nèi)切酶NdeI、Hind Ⅲ和T4 DNA連接酶(Takara)；質(zhì)粒小量制備提取試劑盒(上海捷瑞)。

引物合成與基因測序由上海生工完成。高效液相色譜檢測所用標準品為：雄烯二酮(Androstene)，9-羥基雄烯二酮(9-hydroxy-4-Androstene-3,17-dione)，購自上海阿拉丁生化科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(IPTG誘導(dǎo))以及優(yōu)化過的ZYM培養(yǎng)基(自誘導(dǎo))用于重組蛋白的表達研究。通過重組蛋白質(zhì)的可溶性表達水平比較，選擇ZYM培養(yǎng)基作為雄烯二酮生物羥化功能研究的培養(yǎng)基，配方如表1。

表 1 ZYM培養(yǎng)基成分

1.2 svu005的基因分析及分子克隆

以Gene Ontology、KEGG和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫為主要數(shù)據(jù)庫對svu005進行注釋，根據(jù)注釋的結(jié)果，進一步從NCBI下載了鏈霉菌屬中已發(fā)現(xiàn)的CYP105全部亞家族的代表基因，使用MEGA6.0[16]構(gòu)建svu005的系統(tǒng)進化樹，鑒定其表達蛋白類型。

根據(jù)S.virginiaeIBL14全基因組數(shù)據(jù)，使用Primer Premier5.0進行引物設(shè)計。上游引物svu005-F序列為5′-CCCATATGGTGTTGTTCTCCATGTCCGAAGCCC-3′，下劃線標注為NdeI酶切位點；下游引物svu005-R序列為5′-CCAAGCTTCACCACGCCACCGGCAGTTC-3′，下劃線標注為Hind III酶切位點。

優(yōu)化后的PCR的擴增程序為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性25 s，65 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴增獲得的基因片段產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒(上海生工)純化回收。

1.3 CYP105D1原核表達載體的構(gòu)建

對svu005的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a使用NdeI酶和Hind III酶進行雙酶切。酶切產(chǎn)物使用T4連接酶連接，構(gòu)建表達重組質(zhì)粒pET28a-svu005。構(gòu)建過程如圖1。重組質(zhì)粒pET28a-svu005轉(zhuǎn)入采用SSCS試劑盒一步法制備的E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞，構(gòu)建工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005。

圖 1 重組質(zhì)粒pET28a- svu005的構(gòu)建過程

通過菌落PCR篩選陽性克隆，傳代培養(yǎng)6次，使用質(zhì)粒小量制備提取試劑盒(上海捷瑞)提取質(zhì)粒，使用NdeI酶進行單酶切驗證，同時使用NdeI酶和Hind III酶進行雙酶切驗證，酶切產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)有限公司測序驗證。

1.4 CYP105D1蛋白的誘導(dǎo)表達及活性測定

將工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的對照菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a分別培養(yǎng)至OD600為0.6時取出，4 ℃保存為種子液。各使用30 mL的含有50 μg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基和ZYM液體培養(yǎng)基3組，平行接種300 μL種子液，LB液體培養(yǎng)基于30 ℃，220 r/min培養(yǎng)4 h后使用IPTG(終濃度0.5 mmol/L)誘導(dǎo)蛋白表達8 h，ZYM液體培養(yǎng)基于30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，并自誘導(dǎo)svu005蛋白表達。重懸于PBS緩沖液中，超聲破碎菌體后，10 000 r/min離心10 min，分離可溶性蛋白和沉淀蛋白，對CYP105D1的表達情況進行SDS-PAGE電泳檢測。

取離心分離的上清液，使用Lowery法測定上清液總蛋白含量。使用CO差示法測定CYP的表達量，在石英比色皿中加入1.5 mL P450測定液和50 μL連二亞硫酸鈉，分別加入20 μL待測上清液，混勻。1 min后使用紫外分光光度儀分別在450 nm和490 nm波長測量基準吸收值。同樣的樣品通入CO約2 min，穩(wěn)定1 min分別在450 nm和490 nm波長測量，記錄450 nm和490 nm處吸收值，按以下公式計算P450含量。

1.5 CYP105D1蛋白羥化雄烯二酮的功能鑒定

以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a作為對照，使用ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)4 h后，加入1 mL摩爾濃度為1 mmol/L的雄烯二酮(Androstene)，反應(yīng)8 h后，使用乙酸乙酯萃取，加入無水硫酸鈉脫水30 min，取上層澄清的乙酸乙酯，37 ℃干燥，1 mL甲醇復(fù)溶。使用HPLC(Breeze 1525 series, Waters Co., USA)進行檢測，分析柱為250 mm Symmetry C 18(4.6 mm×250 mm, Waters Co., USA)，進樣體積為10 μL。流動相為乙腈∶水=60∶40，檢測波長281 nm。

2 結(jié)果和分析

2.1 svu005基因分析及分子克隆結(jié)果

PCR擴增獲得的svu005序列，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。svu005基因全長1224 bp，電泳顯示的擴增條帶大小相符，目的條帶清晰明亮，單一無雜帶，說明本次設(shè)計的引物可以高效的擴增svu005，擴增結(jié)果較為理想。

M:DNA ladder;1:svu005基因

圖2svu005的擴增結(jié)果

Figure 2 PCR products ofsvu005

svu005的表達蛋白Svu005(NCBI：JK119065)被Gene Ontology、KEGG和Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫注釋為CYP105D，進一步從NCBI下載了鏈霉菌屬的CYP105亞家族的代表基因。包括Streptomycesgriseolus的CYP105A1(P18326)、CYP105B1(P13827)、CYP105D1(P26911)；Streptomycessp.中的CYP105C1(P23296)；Streptomyceslavendulae中的CYP105F1(Q9X5P8)；Streptomycesnoursei中的Q9L4W8(CYP105H1)；Streptomycestenda中的CYP105K1(Q9X9P7)；Streptomycesfradiae中的CYP105L1(Q9ZHQ1)；Streptomycesclavuligerus中的CYP105M1(Q9KJ93)；Streptomycescoelicolor中的CYP105N1(Q9EWP1)和CYP105V1(Q6V1N2)；Streptomycesavermitilis中的CYP105P1(Q79ZT4)和CYP105Q1(Q82MP9)和CYP105R1(Q93HF0)；Streptomyceshygroscopicus中的CYP105U1(Q84G11)；Streptomycesscabies中的CYP105Z1(C9ZGE5)；Streptomycestubercidicus的CYP105AA1(Q595R1)。以Streptomycesavermitilis中的CYP1(BAC67818)為外群，使用MEGA6.0[16]基于距離矩陣鄰接法構(gòu)建的svu005表達蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖3?；谝陨辖Y(jié)果，svu005的表達產(chǎn)物鑒定為CYP105D1。對其表達蛋白的進一步分析發(fā)現(xiàn)，svu005編碼的CYP105D1含有408個氨基酸，分子量為45.141 62 ku，等電點PI值為5.31，具有CYP蛋白I-helix(G247HETT251)、K-helix(E285LMR288)和Heme binding otif(H346LAFGFGIHQCLG358)3個保守結(jié)構(gòu)域。

圖3 距離矩陣鄰接法構(gòu)建的鏈霉菌屬CYP105家族基因系統(tǒng)進化樹

2.2 重組表達質(zhì)粒pET28a-svu005的構(gòu)建及驗證

將質(zhì)粒pET28a和svu005擴增序列同時使用NdeI酶和Hind III酶進行雙酶切，使用T4連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a-svu005。E.coliBL21(DE3)培養(yǎng)至OD600值為0.6時，取1 mL菌液，按照SSCS試劑盒的操作步驟，一步法制得E.coliBL21(DE3)的感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒感受態(tài)的E.coliBL21(DE3)，取30個菌落進行PCR篩選時，顯示出極高的轉(zhuǎn)化效率，陽性克隆占93%。使用質(zhì)粒小量制備提取試劑盒(上海捷瑞)抽提重組質(zhì)粒，NdeI酶單酶切驗證及NdeI酶/Hind III酶雙酶切驗證，結(jié)果如圖4。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET28a-svu005被NdeI單酶切切開的線性片段長度在6000 bp左右，符合預(yù)期大小，重組質(zhì)粒pET28a-svu005被Hind III和NdeI切成兩個長度不等的片段，長度大于4000 bp的大片段為pET28a的雙酶切產(chǎn)物，長度在1000 bp至1500 bp之間的小片段為重組基因svu005的雙酶切產(chǎn)物，片段大小符合預(yù)期。svu005酶切片段回收后送生工生物工程上海有限公司測序，測序結(jié)果顯示序列正確，無位點突變。

M：3000 bp DNA ladder;1:pET28a-svu005NdeI單酶切結(jié)果;2：pET28a-svu005Hind III和NdeI雙酶切結(jié)果;3:pET28a-svu005原始質(zhì)粒

圖4pET28a-svu005重組質(zhì)粒酶切驗證

Figure 4 Restriction enzyme digestion verification of pET28a-svu005

2.3 CYP105D1重組蛋白的表達及活性

SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的重組菌株，目的蛋白CYP105D1得到表達，蛋白質(zhì)分子量與預(yù)期的蛋白質(zhì)分子量45.1 ku大小一致，但是基本上都以不可溶的包涵體形式存在(圖5-A)。自誘導(dǎo)ZYM培養(yǎng)基同樣存在的包涵體形式表達，但上清液中也有明顯的CYP105D1可溶性表達(圖5-B)。

A中，M：蛋白質(zhì)Marker； 1：E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005誘導(dǎo)破碎后的沉淀； 2：E.coliBL21(DE3)/pET28a誘導(dǎo)破碎后的沉淀； 3：E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005誘導(dǎo)破碎后的上清； 4：E.coliBL21(DE3)/pET28a誘導(dǎo)破碎后的上清。B中，M：蛋白質(zhì)Marker； 1：E.coliBL21(DE3)/pET28a誘導(dǎo)破碎后的上清； 2：E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005誘導(dǎo)破碎后的上清； 3：E.coliBL21(DE3)/pET28a誘導(dǎo)破碎后的沉淀； 4：E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005誘導(dǎo)破碎后的沉淀

圖5(A)LB培養(yǎng)基中IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白CYP105D1的SDS-PAGE檢測；(B)ZYM培養(yǎng)基中自誘導(dǎo)表達重組蛋白CYP105D1的SDS-PAGE檢測

Figure 5 (A)SDS-PAGE analysis of the CYP105D1 from the recombination strain in LB medium，(B)SDS-PAGE analysis of the CYP105D1 from the recombination strain in ZYM medium

OD600的測量結(jié)果表明，ZYM培養(yǎng)基在12 h的培養(yǎng)時間內(nèi)，菌體產(chǎn)量較高(表2)?；钚缘鞍椎臏y定結(jié)果顯示，CYP105D1蛋白在ZYM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下自誘導(dǎo)的CYP蛋白平均產(chǎn)量為0.0916 nmol/L，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下使用IPTG誘導(dǎo)的CYP蛋白平均產(chǎn)量為0.0367 nmol/L。自誘導(dǎo)條件下CYP蛋白的可溶性表達量顯著性(P= 0.002 208, One way ANOVA檢驗，Permutaionn= 99 999)高于傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)方式(表2)。因此，本研究使用ZYM培養(yǎng)基自誘導(dǎo)表達是CYP105D1的優(yōu)化表達策略，顯著提高了CYP105D1蛋白的可溶性表達效率。

2.4 CYP105D1對雄烯二酮的羥化功能鑒定

本研究還嘗試過在CYP105D1蛋白的N端添加組氨酸標簽，分離純化CYP105D1蛋白進行功能研究，但是分離的含組氨酸融合標簽CYP105D1蛋白不具有生物活性，因此后續(xù)功能驗證研究均以載入空質(zhì)粒pET28a的菌株作為對照菌株，使用重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005進行菌體內(nèi)生物催化。使用ZYM培養(yǎng)基自誘導(dǎo)12 h后，svu005表達的CYP105D1蛋白可以有效的羥化雄烯二酮?；谛巯┒腃9位是最常見的羥基化位點，使用9-羥基雄烯二酮的標準品檢測，其保留時間與E.coliBL21(DE3)/pET28a-svu005以雄烯二酮為底物的羥化產(chǎn)物保留時間一致(圖6)。改變不同的洗脫條件，該產(chǎn)物峰的保留時間均與標準品一致，因此初步鑒定羥化產(chǎn)物為9-羥基雄烯二酮。

表2 不同誘導(dǎo)方式下CYP105D1產(chǎn)量比較

注：*P值<0.01, One way ANOVA檢驗，Permutaionn=99 999

圖6 重組菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a，E. coli BL21(DE3)/pET28a-svu005生物轉(zhuǎn)化雄烯二酮的HPLC分析

3 討論

CYP蛋白在重組表達時，其含鐵原子的卟啉環(huán)輔基[17]是蛋白質(zhì)正確折疊的關(guān)鍵[18]，IPTG的誘導(dǎo)極易形成包涵體，且對菌體具有毒害作用，影響菌體的生長。LB培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分較為簡單，因此難以實現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)[19]。而本研究優(yōu)化的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富且不添加IPTG誘導(dǎo)劑，不存在IPTG對細菌的生長的抑制，同時增加可溶性蛋白的表達量[20]。3組平行樣品的OD600值顯示，使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下，重組菌的生長及可溶性蛋白含量均優(yōu)于使用LB培養(yǎng)基。張彭湃等人使用乳糖代替IPTG誘導(dǎo)P450 BM-3在大腸桿菌中可溶性表達，目標蛋白量提升2.13倍[21]，而本研究中，含乳糖成分的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基使CYP蛋白的活性表達提升了2.5倍。因此相較于傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)，本研究采用的自誘導(dǎo)培養(yǎng)是CYP蛋白重組表達的有效培養(yǎng)條件，可以顯著提高CYP蛋白的可溶性表達。CYP蛋白的正確折疊需要含鐵原子的卟啉環(huán)作為輔基，其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)折疊較為復(fù)雜，將包涵體變性后復(fù)性難以重新折疊生成有活性蛋白。另外，CYP催化的羥化反應(yīng)需要一系列的輔酶還原NADH，以保證反應(yīng)的持續(xù)進行。因此在進一步研究中，可以采用添加卟啉環(huán)及其合成前體、添加或共表達P450還原酶輔酶[22-23]等措施進一步提高CYP蛋白的活性表達及轉(zhuǎn)化效率。

CYP基因可以催化各種復(fù)雜的反應(yīng)，包括不同底物的氧化、羥化等，其催化反應(yīng)具有區(qū)域選擇性和立體化學(xué)型[24]。對于化學(xué)方法難以實現(xiàn)羥基化的復(fù)雜底物，CYP105家族基因可以在其飽和碳氫鍵位置引入羥基[25]，例如華法林、紅霉素、樟腦、苯并芘和7-乙氧基香豆素均可作為被CYP105D1的羥化底物，磺酰脲類可以被CYP105A1和CYP105b1羥化[26-28]。尤其在甾體類藥物生產(chǎn)中，CYP105是最重要的羥化酶[29]。其成員CYP105S可以甾醇類物質(zhì)為底物，合成大環(huán)內(nèi)酯化合物，同時還具有從羥化、氧化到脫烷基化的連續(xù)反應(yīng)[13]。CYP105A1可以連續(xù)在維生素D3的兩個不同的位點進行特異性羥化[30]。顯然CYP105家族蛋白在甾體藥物的微生物轉(zhuǎn)化方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究驗證了S.virginiaeIBL14的svu005基因編碼的CYP105D1蛋白可以有效地羥化雄烯二酮為9-羥基雄烯二酮，CYP105D1蛋白的催化機理和已發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌屬與紅球菌屬中的3-甾酮-9α-羥基化酶不同，其羥化產(chǎn)物均一，無明顯副產(chǎn)品產(chǎn)生，提供了9-羥基雄烯二酮的微生物轉(zhuǎn)化的新途徑。對該生物催化反應(yīng)的進一步優(yōu)化，可以改變9-羥基雄烯二酮傳統(tǒng)生產(chǎn)的繁瑣過程，降低生產(chǎn)成本，改善生產(chǎn)過程對環(huán)境的污染，對探索微生物轉(zhuǎn)化在甾體藥物的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。