鄭航輝, 高 昇, 楊宇澤, 吳 潤, 萬學(xué)瑞, 王 川, 劉 磊

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070； 2. 北京市畜牧總站， 北京 100101)

騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4是1998年我國科學(xué)家從云南騰沖縣的熱泉里分離出的一株嗜熱厭氧菌株，在50 ℃到80 ℃之間生長，最適生長溫度是75 ℃[1]，同時也是我國第一個完成全基因組測序和基因注釋的原核微生物[2]。為什么嗜熱菌可以在相對苛刻的條件下生長和繁殖？研究者從不同的角度對嗜熱菌的嗜熱機制進行了廣泛而深入的探究，所涉及的方面包括嗜熱菌的細胞膜的結(jié)構(gòu)和流動性以適應(yīng)高溫[3-5]、蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)對高溫的適應(yīng)[6-9]、酶的結(jié)構(gòu)和功能及金屬離子的保護作用等[10]。此外，截至2017年超過80株嗜熱微生物的全基因組序列被發(fā)布，通過比較嗜熱菌和常溫細菌的生物學(xué)信息，分析嗜熱機制也是一個研究方向，包括基因組的GC含量[11]；氨基酸的組成和使用頻率[12-13]等。雖然嗜熱菌單一因素的嗜熱機制被廣泛研究，但由于細菌的生命活動在很大程度上是一個很復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，因此對嗜熱微生物嗜熱機制進行更廣泛和深入地分析不僅有助于我們對原始地球環(huán)境的理解以及生物進化機制的研究，而且還能促進一些耐熱蛋白、耐熱酶等活性物質(zhì)在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。

AhpC是一種硫氧還原蛋白依賴的烷基過氧化氫還原酶，能夠還原有毒的氫化氧化物[14]。AhpC是細菌清除自由基的一種主要成分，如果烷基過氧化氫還原酶基因功能缺陷就會導(dǎo)致包括形態(tài)學(xué)和細胞表面性質(zhì)在內(nèi)的表型改變[15]。AhpC可以催化減少過氧化氫和過氧化物，參與到冷壓力或熱壓力反應(yīng)過程中[16]。依據(jù)測序完成的基因組數(shù)據(jù)和已發(fā)現(xiàn)AhpC家族的其他生物學(xué)信息，騰沖嗜熱厭氧菌基因tte0270被注釋為ahpC的一種。我們通過使用騰沖嗜熱厭氧基因組作為模板克隆ahpC并體外表達AhpC，希望使用生物信息學(xué)手段來分析AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱性中發(fā)揮的作用，希望為日后研究騰沖嗜熱菌的嗜熱機制提供重要的信息，為嗜熱機制的闡明奠定良好的工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-28a，感受態(tài)菌E.ColiBL21 (DE3)和E.coliDH5α為本實驗室保藏；騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4菌株由中國科學(xué)院微生物研究所譚華榮研究員惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

騰沖嗜熱厭氧桿菌培養(yǎng)基(TTE培養(yǎng)基)用于騰沖嗜熱厭氧桿菌培養(yǎng)[17]；2×YT培養(yǎng)基用于重組菌的誘導(dǎo)，LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)的培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

XhoⅠ、RNase Inhibitor、BamHⅠ、DNase I、T4 DNA Ligase購自大連寶生物工程公司； IPTG、卡那霉素、FastPfu fly DNAPolymerase均購自TransGen Biotech有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶Super Script Ⅲ購自Invitrogen；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自TIANGEN公司；鎳離子親和柱購自GE公司；超純RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自Roche公司。其他試劑購自國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

參照GenBank中騰沖嗜熱菌MB4(AE008691.1)ahpC在GenBank中的序列設(shè)計引物，并送金唯智科技有限公司合成。引物序列如下：ahpC-F:5′-CGCGGATCCATGGAGGAAATTAG-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)；ahpC-R:5′-CCGCTCGAGTTTCAAAGGTTTGTGTACG-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。

1.2.2 騰沖嗜熱厭氧桿菌基因組DNA的提取

在TTE培養(yǎng)基中75 ℃培養(yǎng)騰沖嗜熱厭氧桿菌，使用試劑盒提取嗜熱菌基因組DNA。

1.2.3ahpC基因的擴增

以提取的基因組DNA為模板進行擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性35 s，50.7 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)。將ahpC和pET-28a雙酶切，16 ℃連接，將其轉(zhuǎn)化到DH5α中，提取質(zhì)粒，雙酶切判定，測序正確后，將其定名為pET-28a::ahpC。

1.2.4 AhpC蛋白的表達及純化

將pET-28a::ahpC轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21(DE3)中，表達及純化方法參照文獻[18]。為分析AhpC蛋白表達情況，以誘導(dǎo)前、后的菌液作為對照進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 RNA提取及實時定量RT-PCR

ahpC上游引物：5′-CGACTGAAAGCCCAATGAGT-3′，下游引物5′-GCAGGAAAATGGTTTGTGCT-3′；16sRNA上游引物：5′-CGTAGGCGGTTTAGCAAGTC-3′，下游引物：5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′。

分別在50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃培養(yǎng)厭氧桿菌。RNA提取及RT-PCR方法參照文獻[17]。以16s RNA作為內(nèi)參基因，采用相對定量的方法檢測了50 ℃、60 ℃、75 ℃和80 ℃下騰沖嗜熱菌ahpCRNA的表達量變化。反應(yīng)結(jié)束后對 Ct 值采用 2-ΔΔCt法進行定量分析。分別對每個溫度的 3 個生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)進行分析，使用 SPSS 軟件進行 ANOVA單因素方差分析，P<0.05，表示有顯著性差異。

1.2.6ahpC序列的生物信息學(xué)分析

選擇騰沖嗜熱厭氧桿菌(AE008691.1)、嗜冷菌單核細胞增生李斯特菌(NC_017537.1)、常溫菌大腸桿菌(NC_000913.3)的ahpC基因序列，使用在線軟件Prot-Param分析騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌基因序列編碼氨基酸序列組成及其理化性質(zhì)[30]；使用在線軟件 ProtScale分析3種AhpC蛋白疏水性；使用在線軟件 TMHMM v.2.0預(yù)測騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白跨膜區(qū)；使用在線軟件 PORTER來預(yù)測騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白二級結(jié)構(gòu)；使用程序SignalP 3.0 Server分析騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白信號肽；使用在線軟件SWISS-MODEL/ SWISS-PdbView等，按照同源建模法構(gòu)建出騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌菌株AhpC蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ahpC的PCR擴增結(jié)果及pET-28a::ahpC重組質(zhì)粒酶切驗證

經(jīng)PCR擴增出的ahpC片段與已知的目的基因片段長度相符(圖1)，測序結(jié)果表明ahpC大小為663 bp。

M：DNA分子質(zhì)量標準DL 5000；1：pET-28a::ahpC雙酶切；2：pET-28a質(zhì)粒雙酶切；3：ahpC基因PCR產(chǎn)物

M:DL 5000 DNA Marker; 1：Double endonuclease digestion product of pET-28a::ahpC; 2:Double endonuclease digestion product of pET-28a; 3：PCR products ofahpC

圖1ahpC的PCR擴增產(chǎn)物及pET-28a::ahpC重組質(zhì)粒雙酶切

Figure 1 Electrophoresis of PCR products of objective gene and pET-28a::ahpCrecombinant plasmid digested

2.2 AhpC蛋白的純化

通過SDS-PAGE 發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后菌體沉淀出現(xiàn)特異性條帶，而誘導(dǎo)前菌體沉淀無特異條帶，純化后在25～35 ku之間出現(xiàn)單一條帶，AhpC蛋白大小符合預(yù)期(圖2)。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1、2、3：純化后的 pET28a-AhpC表達蛋白；4：誘導(dǎo)后的pET28a-AhpC菌液；5:未誘導(dǎo)的pET28a-AhpC菌液

M：Protein molecular weight Marker；1，2，3：Purification recombinant expressed protein pET-28a::ahpC；4：pET-28a::ahpCinduced with IPTG ；5：pET-28a::ahpCnot induced with IPTG

圖2AhpC表達產(chǎn)物的SDS-PAGE

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the AhpC expressed product

2.3 ahpC在不同溫度下的轉(zhuǎn)錄分析

將50 ℃的表達量定義為1，結(jié)果顯示：在60 ℃、75 ℃和80 ℃表達量是相對于50 ℃表達量的3.9倍、13.6倍和26.5倍(圖3)。明顯看出隨著溫度的升高ahpC表達量增高，ahpC的表達與溫度呈正相關(guān)。

16S RNA作為內(nèi)參基因，50 ℃時ahpC表達量作為1

16SrRNA was used as internal control, and the transcription at 50 ℃ was arbitrarily assigned as relative 1

圖3ahpC在50℃、60℃、75℃和80℃下的轉(zhuǎn)錄分析

Figure 3 Relative transcriptional level ofahpCunder 50 ℃, 60 ℃, 75 ℃ and 80 ℃

2.4 騰沖嗜熱菌ahpC及AhpC的生物信息學(xué)分子特征

2.4.1ahpC序列及AhpC氨基酸序列的分子特征

通過在線程序EXPASY分析得到騰沖嗜熱菌ahpC基因全長663 bp,其中A堿基146個(22.0%)、T堿基243個(36.7%)、G堿基125個(18.9%)、C堿基149個(22.5%)，AhpC編碼220個氨基酸，AhpC分子質(zhì)量約為26 ku，等電點(pI)為6.126，分子式為C1158H1795N299O323S7。通過生物信息學(xué)分析比較了ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：騰沖嗜熱菌AhpC中脯氨酸含量比大腸桿菌高1.3%，比李氏桿菌高1.3%；騰沖嗜熱菌AhpC中Arg和Lys含量分別為4.1%和8.6%，大腸桿菌為3.2%和7.5%，李氏桿菌為2.7%和4.8%；騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%。騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC中Leu含量為7.3%，Ile為6.8%，大腸桿菌和李氏桿菌中均為7.0%和5.9%。騰沖嗜熱菌AhpC中Cys含量為0.5%，大腸桿菌為1.1%，李氏桿菌為2.1%(表1)。

2.4.2ahpC編碼蛋白質(zhì)的疏水性分析

疏水性對蛋白三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成和穩(wěn)定具有關(guān)鍵作用，在線程序ProtScale對AhpC的氨基酸序列進行疏水性分析，蛋白疏水性平均值為-0.272，最大值為1.700，最小值為-2.311,不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為31.99，脂肪系數(shù)為89.00，表明為親水蛋白。潛在疏水區(qū)分別位于16～17、34～42、45～47、49～53、69～79、81～82、95～105、111～112、124～140、142、153～160、166～167、181～184、186～188位aa。其中疏水性最強的是位于第95～105位的氨基酸。

表1 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)

2.4.3 AhpC跨膜區(qū)、信號肽位點的預(yù)測

經(jīng)過預(yù)測騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，也不存在信號肽位點。

2.4.4 AhpC蛋白二級結(jié)構(gòu)和AhpC三級結(jié)構(gòu)特征預(yù)測

應(yīng)用Predict Protein 工具分析顯示：利用在線程序PORTER軟件預(yù)測AhpC的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，有64個(19.1%)氨基酸殘基參與形成α-螺旋，有99個(45%)氨基酸殘基組成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)，有57個(25.9%)氨基酸殘基參與構(gòu)成β-折疊。同時對AhpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌、李氏桿菌中編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)氨基酸殘基進行比較結(jié)果如表2所示。使用在線軟件 SWISS-MODEL/SWISS-PdbView 等，根據(jù)同源建模法預(yù)測出ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。如圖5所示，騰沖嗜熱菌的AhpC的三級結(jié)構(gòu)比其他兩種菌株更緊湊。

H：α-螺旋；C：無規(guī)卷曲；E：β-折疊

H：Α-helix；C：Random coil；E：β-extension

圖4騰沖嗜熱厭氧桿菌AhpC蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
Figure 4 Prediction of secondary structure of AhpC ofThermoanaerobactertengcongensis

3 討論

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是研究嗜熱微生物嗜熱機制的熱點和關(guān)鍵。通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高ahpCmRNA表達量顯著升高，Liu等人[19]發(fā)現(xiàn)敲除ahpC會導(dǎo)致騰沖嗜熱厭氧桿菌死亡，我們推測ahpC編碼蛋白在騰沖嗜熱厭氧桿菌嗜熱過程中起到重要作用。

表2 ahpC在騰沖嗜熱菌、大腸桿菌以及李氏桿菌所編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)比較

A、B和C分別代表AhpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和單核細胞增生李斯特菌中編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

A, B and C were the representative of AhpC in the three level structure prediction of the coding protein ofThermoanaerobactertengcongensis,EscherichiacoliandListeriamonocytogenes

圖5AhpC三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

Figure 5 Prediction of tertiary structure of AhpC

使用生物信息學(xué)分析ahpC在騰沖嗜熱厭氧桿菌、大腸桿菌和李氏桿菌中編碼蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)3個菌株在CG含量、氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面有明顯差異。蛋白質(zhì)中各種氨基酸殘基的含量和分布會對極端嗜熱蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)氨基酸側(cè)鏈對蛋白質(zhì)的嗜熱性質(zhì)可能起決定性作用[20]。脯氨酸(Pro)具有最低的構(gòu)象熵[21]；半胱氨酸(Cys)在高溫條件下易發(fā)生氧化作用；堿性氨基酸賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)均參與離子鍵的形成，并且在高溫條件下精氨酸所參與形成的離子鍵熱穩(wěn)定性更強[22]。將騰沖嗜熱菌的AhpC與來自常溫菌的大腸桿菌和來自嗜冷菌的李氏桿菌的AhpC氨基酸序列進行比較發(fā)現(xiàn)，騰沖嗜熱菌AhpC中Pro、Arg含量高于大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量，而Lus、Cys含量比大腸桿菌和李氏桿菌低。蛋白質(zhì)的疏水性在促進蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性中也起到了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)的側(cè)鏈疏水性最強，而較大的疏水作用可以使肽鏈折疊成更加緊密的結(jié)構(gòu)，這有利于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[23]，而騰沖嗜熱菌AhpC中Leu和Ile 含量高于在大腸桿菌和李氏桿菌AhpC中的含量。

騰沖嗜熱菌AhpC不存在跨膜區(qū)域，說明該蛋白可能是非表面結(jié)構(gòu)蛋白，也不存在信號肽，表明AhpC為非分泌蛋白。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)作為一級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的樞紐，是預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵點，經(jīng)過預(yù)測騰沖嗜熱菌AhpC屬于混合型蛋白[24]。較多的α-螺旋氨基酸殘基的存在有利于蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[25]，并且α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成會使蛋白分子表面 loop結(jié)構(gòu)長度縮短，有利于提高蛋白分子的熱穩(wěn)定性[26]，而α-螺旋在騰沖嗜熱菌AhpC中含量高于大腸桿菌和李氏桿菌。對騰沖嗜熱菌、大腸桿菌和李氏桿菌的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)騰沖嗜熱菌的AhpC蛋白三級結(jié)構(gòu)明顯比另外兩種菌株更緊湊，這有利于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定。

本研究發(fā)現(xiàn)騰沖嗜熱菌ahpC表達量與溫度呈正相關(guān)，并進一步利用生物信息學(xué)分析了AhpC蛋白熱穩(wěn)定性高于大腸桿菌和李氏桿菌的AhpC蛋白的原因。騰沖嗜熱厭氧桿菌中AhpC的存在明顯增強了其環(huán)境適應(yīng)性。本研究為未來騰沖嗜熱菌的嗜熱機制的闡明提供重要的信息，為嗜熱機制的研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。