楊 越， 朱家佳， 唐 乖， 龍鼎新

(南華大學 公共衛(wèi)生學院， 衡陽 421001)

鈣離子(Calcium，Ca2+)是廣泛存在于細胞內(nèi)的第二信使，其參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)細胞增殖、分化、細胞自噬與細胞凋亡等各種生理過程[1]。目前，已知最大的鈣離子釋放通道蛋白Ryanodine受體(Ryanodine receptor, RyR)是以植物生物堿Ryanodine命名的[2]。RyR是從肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細胞內(nèi)貯存中釋放鈣的一種離子通道[3-4]。該通道位于肌肉、神經(jīng)元和許多其他類型細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。已知的RyR有3種亞型(RyR1、RyR2、RyR3)，RyR1主要在骨骼肌中表達，RyR2在心肌中高水平表達，而RyR3在不同組織中普遍表達，但在腦和膈膜中相對豐富[5]。并且RyR調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)鈣離子濃度變化是一系列生物過程的基礎(chǔ)[6]。異常RyR介導的Ca2+釋放已經(jīng)與惡性高熱[7]、心力衰竭[8]和神經(jīng)變性疾病[9]等幾種疾病密切相關(guān)[10]。

細胞含有多種與RyR相互作用的蛋白質(zhì)分子，并可以對其活性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因此，RyR 在許多信號通路中均有重要作用，雖然目前已展開對于此類大分子晶體的研究，但對于其詳細的結(jié)構(gòu)信息分析目前還沒有研究者對其進行整合。因此本文擬基于生物信息學方法，首次對人RyR蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等進行分析整理，為RyR的機制研究及生物學實驗等提供重要的參考依據(jù)，幫助研究人員找到調(diào)查基因以及蛋白質(zhì)的線索。

1 材料與方法

在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中搜索并下載人RyR序列；使用ProtParam程序[11](http://web.expasy.org/protparam)預測RyR 3種亞型蛋白的理化性質(zhì)；利用Protscale程序[11](http://web.expasy.org/protscale)進行疏水性分析；使用ExPASy-GOR IV(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)進行二級結(jié)構(gòu)預測；使用SignalP4.1Server[12](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析信號肽切割；使用ProtComp 9.0在線(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)進行亞細胞定位預測；使用TMHMM Serverv.2.0(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)進行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測；使用NetPhos 2.0 Server[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測磷酸化位點；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)分析蛋白信息；使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)進行同源搜索，并利用ClustalX[14]軟件進行多序列比對分析，隨后使用MEGA5[15]軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 人RyR蛋白序列的查找

根據(jù)文獻報道，已有3種人RyR亞型被確認，其NCBI序列號分別為: AAA60294、NP_001026、CAA04798。按序列號搜索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得它們的氨基酸序列，并將其分別命名為RyR1、RyR2和RyR3。

2.2 RyR理化性質(zhì)分析

使用ProtParam分析RyR 3種亞型理化性質(zhì)、分子式、分子量和等電點等，結(jié)果詳見表1。

隨后利用Protscale對RyR蛋白進行疏水性和親水性分析，如表2及圖1所示。結(jié)果進一步表明，3種RyR蛋白均為親水性蛋白。

圖1 RyR蛋白疏水性/親水性預測

表1 RyR蛋白理化性質(zhì)

表2 RyR蛋白親水性與疏水性氨基酸殘基位置

2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

主要多肽鏈的空間原子的排列決定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用GOR IV二級結(jié)構(gòu)預測模塊計算RyR二級結(jié)構(gòu)，并繪制結(jié)構(gòu)模型(表3及圖2)。 結(jié)果顯示RyR蛋白含有大量α-螺旋及無規(guī)則卷曲，約占85%，推測其為RyR主要的二級結(jié)構(gòu)原件。

表3 RyR蛋白二級結(jié)構(gòu)特征

圖中A、B、C的上部為示意圖；下部為高峰數(shù)字。藍色：α-螺旋；紅色：延伸鏈；紫色：不規(guī)則的卷曲結(jié)構(gòu)

圖2RyR蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

Figure 2 Secondary structure analysis of RyR proteins

2.4 信號肽切割位點預測

使用SignalP-4.1來預測RyR蛋白信號肽及切割位點。結(jié)果顯示，RyR蛋白沒有信號肽位點，屬于非分泌性蛋白(表4)。

2.5 亞細胞定位預測

使用ProtComp 9.0軟件在線預測RyR蛋白亞細胞定位，提示其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(表5)。

2.6 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

使用TMHMM在線軟件進行RyR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3所示，RyR蛋白均為跨膜蛋白。

表4 RyR蛋白質(zhì)信號肽切割位點預測

注：Max. C表示原始切割位點評分最大值；Max. Y表示合并的切割位點評分最大值；Max. S表示信號肽評分最大值；Mean S表示可能的信號肽的平均S值；D表示平均值S和Y分數(shù)最大值的加權(quán)平均值，用于區(qū)分是否為信號肽的分數(shù)

表5 RyR蛋白亞細胞定位預測

2.7 磷酸化位點分析

使用NetPhos 2.0 Server Online預測RyR蛋白磷酸化位點，結(jié)果見表6。結(jié)果為可能的蛋白激酶磷酸化位點分布。

表6 RyR蛋白磷酸化位點

2.8 RyR蛋白信息預測

PredictProtein是歐洲分子生物學實驗室提供的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的在線預測網(wǎng)站，可從中獲得蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、二硫鍵、跨膜螺旋等信息。RyR蛋白結(jié)合位點，跨膜結(jié)構(gòu)域和二硫鍵在線預測結(jié)果見圖4、圖5和圖6。預測結(jié)果顯示RyR蛋白均具有多蛋白結(jié)合位點，跨膜結(jié)構(gòu)域與TMHMM預測結(jié)果一致，均沒有二硫鍵。RyR蛋白分子功能本體論結(jié)果表明：該蛋白具有結(jié)合能力，底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性，離子通道活性，離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等(表7)。RyR蛋白生物學過程本體結(jié)果表明：參與離子運輸、單生物體過程及陽離子轉(zhuǎn)運等(表8)。

圖3 RyR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

圖4 RyR蛋白的結(jié)合位點預測

2.9 多序列對比和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用NCBI 中的BLAST對人RyR蛋白3種亞型序列進行BLASTp 搜索，選擇同一性較高的序列，獲得與RyR1、RyR2、RyR3同源的31個氨基酸序列，對這些序列與RyR各亞型序列進行多序列對比，RyR 3種亞型與已知不同種屬RyR序列分別有95.90%、95.57%和96.79%的序列相似性。隨后利用MEGA5進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，并對其進行聚類分析。系統(tǒng)進化樹聚類分析結(jié)果(圖7)顯示，在RyR的3種亞型中，RyR2與RyR3最先聚為一類，隨后與RyR1聚為一類。對于不同種屬的同源序列之間，RyR的3種亞型均與家兔屬親緣性最近。

圖5 RyR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預測

圖6 RyR蛋白質(zhì)的二硫鍵預測

序號RyRGO:IDGO TermReliability%1RyR1GO:0005488結(jié)合492RyR1GO:0005515蛋白結(jié)合493RyR1GO:0022803被動跨膜轉(zhuǎn)運活性414RyR1GO:0022891底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性415RyR1GO:0022892特異性底物轉(zhuǎn)運活性416RyR2GO:0022803被動跨膜轉(zhuǎn)運活性487RyR2GO:0005488結(jié)合488RyR2GO:0022891底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性489RyR2GO:0022892特異性底物轉(zhuǎn)運活性4810RyR2GO:0015075離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性4811RyR3GO:0005488結(jié)合4812RyR3GO:0022803被動跨膜轉(zhuǎn)運活性4213RyR3GO:0022891底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性4214RyR3GO:0022892特異性底物轉(zhuǎn)運活性4215RyR3GO:0015267通道活性42

表8 RyR生化過程本體論

2.10 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫在線分析RyR的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡，結(jié)果顯示RyR蛋白均與FKBP1B、CALM、TRDN等蛋白具有相互作用(圖8)。

圖7 RyR蛋白與其他物種同源序列的遺傳關(guān)系

網(wǎng)絡節(jié)點表示蛋白質(zhì)，蛋白間的連線表示預測的功能關(guān)聯(lián)。紅線：基因融合；綠線：基因相近；藍線：基因共同產(chǎn)生；紫線：實驗證明；黃線：文本挖掘證據(jù)；淺藍線：輔助數(shù)據(jù)庫證據(jù)；黑線：基因共同表達

圖8RyR蛋白互作網(wǎng)絡

Figure 8 The protein-protein interaction network of RyR proteins

3 討論

Ca2+在生命活動中起著至關(guān)重要的作用, 是影響或決定許多細胞反應的獨立第二信使[16]。而胞內(nèi)Ca2+來源于質(zhì)膜上電壓和受體門控通道以及胞內(nèi)鈣釋放通道IP3R 和RyR介導的鈣釋放[17-18]。RyR是一種主要的鈣誘導鈣釋放(Calcium induced calcium release, CICR)通道，位于神經(jīng)元和大多數(shù)細胞類型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[19]。RyR控制細胞內(nèi)儲存的如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+外流進入細胞質(zhì)的過程[20]。研究發(fā)現(xiàn)，RyR在整個神經(jīng)系統(tǒng)中都大量存在，并通過CICR控制神經(jīng)元中的多種進程，包括囊泡釋放、膜去極化和凋亡等。RyR含有一個大的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，它與蛋白質(zhì)、小分子和信號分子相互作用，調(diào)節(jié)由該通道介導的CICR[21]。在神經(jīng)元中，RyR和L型Ca2+通道之間存在緊密的功能耦合。神經(jīng)元鈣信號在記憶過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，RyR介導的鈣釋放參與了空間記憶過程的獲取和整合[22-23]。特別是在大腦中，RyR參與各種功能，如神經(jīng)元活力、突觸可塑性和更高的認知功能，如學習和記憶等[24]。

由于RyR在機體中參與多種調(diào)控機制，并且目前對大分子晶體的研究愈發(fā)豐富，本文首次對RyR的3種亞型的跨膜結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)等進行分析。結(jié)果顯示RyR 3種亞型定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，均具有跨膜結(jié)構(gòu)，預測其整體為親水性蛋白。有研究報道，RyR蛋白C-末端具有疏水性結(jié)構(gòu)域，并且是跨膜蛋白疏水結(jié)構(gòu)域[25-26]，其跨膜結(jié)構(gòu)域形成離子通道。本文結(jié)果中，顯示在RyR蛋白的C-末端為離子跨膜結(jié)構(gòu)域并具有較高的疏水性氨基酸殘基，且后續(xù)蛋白信息預測RyR蛋白具有離子通道活性、參與離子轉(zhuǎn)運等，與前人結(jié)果一致。RyR所具有的亮氨酸周期性重復出現(xiàn)形成氨基酸拉鏈，其形成的α-螺旋與下一個α-螺旋相互作用，在RyR同源四聚體中起重要作用。二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示3種RyR蛋白均含有大量α-螺旋及無規(guī)則卷曲，推測α-螺旋及無規(guī)則卷曲是RyR的主要二級結(jié)構(gòu)原件。磷酸化以及去磷酸化是重要的細胞內(nèi)的傳導途徑，研究表明RyR過度磷酸化可以增加其對鈣離子敏感性，引起鈣離子紊亂，與心力衰竭以及心律失常等的發(fā)生有著密切關(guān)系[27]。因此對磷酸化位點的分析至關(guān)重要。磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)，RyR 3種亞型都具有Ser、Thr 和Tyr 這3 種磷酸化位點，其中Ser位點較多，因此推測絲氨酸最有可能參與其蛋白磷酸化。近幾年也多有文章報道絲氨酸可能為RyR磷酸化的潛在靶點，但不是唯一靶點[28-29]。對RyR不同物種的序列進行同源分析，結(jié)果顯示不同物種間的序列相似性很高，表明其在進化過程中相對保守，說明其具有重要的功能作用從未得以在進化過程中保留。RyR 3種亞型的聚類分析顯示，RyR2與RyR3最先聚為一類，親緣性較高，隨后與RyR1聚為一類。蛋白質(zhì)不是孤立存在于生物體中的，它們之間的相互作用往往發(fā)揮著重要的生物學功能，蛋白互作網(wǎng)絡分析有助于從系統(tǒng)的角度研究蛋白之間的相互作用，結(jié)果顯示RyR蛋白3種亞型均與FKBP1B、CALM、TRDN等蛋白具有相互作用，F(xiàn)KBP1B可與RyR形成復合體從而穩(wěn)定RyR通道，對其功能進行調(diào)節(jié)[30-31]。鈣離子對RyR活性有重要的影響，CALM可與RyR在胞質(zhì)裝配區(qū)形成復合體，對RyR的活性進行雙向調(diào)節(jié)[32-33]。TRDN是心肌和骨骼肌鈣釋放復合體的一個重要組分，是RyR觸發(fā)骨骼-心肌收縮的關(guān)鍵步驟[34]。

本文從RyR蛋白序列出發(fā)，通過生物信息學分析，為進一步研究RyR調(diào)控機制提供了理論基礎(chǔ)。然而目前生物信息學分析仍存在著一定的局限性，因此采用多軟件多平臺的綜合分析，能夠盡可能降低其預測的局限性，提高預測的準確性。此外，還需根據(jù)預測的結(jié)果，對蛋白重要功能區(qū)域的表達進行一系列后續(xù)實驗驗證，從而判定預測結(jié)果的準確性。