冉皓宇, 陳良標(biāo)

(1. 海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學(xué)) 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部, 上海 201306; 2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué)), 上海 201306; 3. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)), 上海 201306)

水溫是決定魚(yú)類(lèi)幾乎所有生命活動(dòng)的主要因素，影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)[1]、發(fā)育、繁殖、代謝以及地理分布[2]。和大多數(shù)變溫動(dòng)物一樣，魚(yú)類(lèi)也可能會(huì)面臨短時(shí)間內(nèi)或者季節(jié)性的溫度變化，如果水溫的變化超過(guò)了其特定的熱容差范圍，會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)造成不利的影響。自然條件下，長(zhǎng)時(shí)間暴露在超出耐受范圍的低溫條件下，是大多數(shù)魚(yú)類(lèi)死亡的本質(zhì)原因[3]。因此，研究魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)低溫刺激的能力對(duì)于魚(yú)類(lèi)的生存就顯得至關(guān)重要。近年來(lái)有不少研究表明，溫度馴化可以改變魚(yú)類(lèi)的生理活動(dòng)和組織形態(tài)，進(jìn)而去適應(yīng)更低的溫度。通過(guò)低溫馴化的手段可以增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)心臟收縮次數(shù)，抵消血液黏稠的壓力[4]，改變代謝酶活性和游泳速度[5]，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致心臟[6]和肌肉等組織發(fā)生重塑[7]。然而，我們所知道的馴化對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響及其機(jī)制研究，主要對(duì)象都是幼年期或者成年期的動(dòng)物，而長(zhǎng)期的溫度馴化對(duì)魚(yú)類(lèi)早期胚胎發(fā)育的影響則鮮有研究。

魚(yú)類(lèi)胚胎的早期發(fā)育過(guò)程非常復(fù)雜，包括了細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胚層形成和器官形成等生物過(guò)程[8]。在這個(gè)過(guò)程中涉及基因的表達(dá)，多種信號(hào)通路的協(xié)調(diào)互作。無(wú)論是在細(xì)胞層面還是在基因?qū)用?，該階段的生物活動(dòng)需要及時(shí)的能量供應(yīng)[9]。線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的重要細(xì)胞器，合成ATP，為生命活動(dòng)提供能量，同時(shí)在細(xì)胞凋亡和死亡過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用[10]。卵母細(xì)胞的受精和早期胚胎的發(fā)育潛力都受到線(xiàn)粒體數(shù)量的影響[11]。線(xiàn)粒體數(shù)量可以作為評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞和早期胚胎質(zhì)量的重要標(biāo)志[12]。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)進(jìn)行定量是測(cè)定線(xiàn)粒體數(shù)量的有效方法[13]。

在本研究中，我們選擇模式生物斑馬魚(yú)進(jìn)行馴化實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建斑馬魚(yú)低溫馴化模型。正常情況下，斑馬魚(yú)發(fā)育溫度為27 ℃左右，其所產(chǎn)的胚胎半致死溫度(死亡率50%)為22 ℃，臨界致死溫度(死亡率100%)為20 ℃。通過(guò)對(duì)常溫27 ℃發(fā)育至性成熟的斑馬魚(yú)進(jìn)行22 ℃低溫馴化，觀察其胚胎的低溫發(fā)育潛能和mtDNA含量的變化，進(jìn)而探究在斑馬魚(yú)中，對(duì)親本的馴化是否能使其早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)的低溫耐受性，并進(jìn)一步探討其早期胚胎發(fā)育的低溫耐受性與線(xiàn)粒體數(shù)量之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DNA抽提試劑盒(碧云天)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA)；質(zhì)粒小提試劑盒(OMEGA)；T-Vector pMD19 (Simple) (Takara)；NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.2 供試材料

本研究中的斑馬魚(yú)為 AB品系的野生型斑馬魚(yú)，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 飼養(yǎng)的最適宜水環(huán)境為27 ℃～28.5 ℃：培養(yǎng)水溫為27 ℃，pH 7～8，鹽度450～550 μS；通過(guò)自動(dòng)光照系統(tǒng)控制光照周期，分別為明14 h、暗10 h。

1.3 方法

1.3.1 低溫馴化斑馬魚(yú)

取來(lái)自于相同親本，27 ℃正常孵化的6月齡野生型斑馬魚(yú)，均分為2組，每組中保證雌雄比例為1∶1。其中一組在27 ℃正常養(yǎng)殖，作為未馴化對(duì)照組，稱(chēng)為T(mén)E27(The temperature 27 ℃)。另一組，移入恒溫培養(yǎng)箱中，以每小時(shí)1 ℃的速率，逐漸降溫至22 ℃持續(xù)養(yǎng)殖，稱(chēng)為T(mén)A22(Acclimaion temperature 22 ℃)。持續(xù)養(yǎng)殖期間，每個(gè)培養(yǎng)箱中放置8個(gè)3 L的中型斑馬魚(yú)養(yǎng)殖缸，缸中含水量為2 L。每缸養(yǎng)殖8條斑馬魚(yú)，雌雄斑馬魚(yú)各4尾。每個(gè)缸中，分別加入充氣石，保證水中的溶氧。每天早晚各過(guò)量投喂1次豐年蟲(chóng)，保證斑馬魚(yú)飽食。光暗比例為14 h∶10 h，每天8:00開(kāi)啟培養(yǎng)箱關(guān)照燈，22:00關(guān)閉培養(yǎng)箱關(guān)照燈。在晚上投喂3 h后，取27 ℃養(yǎng)殖斑馬魚(yú)的水體，使用冰塊(循環(huán)水體-40 ℃凍結(jié))調(diào)節(jié)水溫至各個(gè)馴化溫度(22 ℃及20 ℃)。在室溫下，迅速給各個(gè)養(yǎng)殖缸換水，使用毛刷清除缸壁和缸底的殘食和黏著物，保證水體新鮮，各項(xiàng)理化指標(biāo)與TE27對(duì)照組一致。

1.3.2 繁殖及耐寒性統(tǒng)計(jì)

當(dāng)馴化6個(gè)月后，將馴化組的斑馬魚(yú)TA22和未馴化對(duì)照組斑馬魚(yú)TE27，在其養(yǎng)殖溫度下，以雌雄比例1∶1的比例配對(duì)放入繁殖缸中。次日8：00開(kāi)啟培養(yǎng)箱光照燈后0.5 h，使斑馬魚(yú)互相追逐、交配、產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后10 min內(nèi)，收集斑馬魚(yú)胚胎至10 cm培養(yǎng)皿中，使用養(yǎng)殖溫度對(duì)應(yīng)溫度的E3培養(yǎng)基清洗后，在22 ℃和20 ℃發(fā)育，檢測(cè)耐寒性并統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3.3 DNA提取

于0 hpf(hour post-fertilization)、8 hpf、12 hpf和24 hpf 4個(gè)發(fā)育時(shí)期收集未馴化組TE27及馴化組TA22的胚胎并提取DNA(包含mtDNA)。兩組均分別從3對(duì)親魚(yú)所產(chǎn)的胚胎中取樣，其中0 hpf 100枚胚胎，8、12和24 hpf均為20枚胚胎。所提取的DNA溶于ddH20，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，將濃度調(diào)至一致，-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)提取野生型斑馬魚(yú)基因組DNA，用于絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備。

1.3.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

選擇線(xiàn)粒體DNA上的mt-nd4，mt-cytb作為目的基因，單拷貝基因actb1作為對(duì)照。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以野生型斑馬魚(yú)總DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)得到線(xiàn)粒體特有基因mt-nd4，mt-cytb以及單拷貝基因actb1的PCR產(chǎn)物。膠回收獲取上述基因PCR純化產(chǎn)物，通過(guò)T-Vector pMD19 (Simple)載體進(jìn)行克隆。轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞后，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR和DNA測(cè)序鑒定后，篩選出目的質(zhì)粒。進(jìn)行質(zhì)粒小提并測(cè)定濃度。

1.3.6 mtDNA相關(guān)基因定量絕對(duì)定量

將獲得的質(zhì)粒等比例梯度稀釋(10倍)獲得6個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，并利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。使用熒光定量PCR儀對(duì)mtDNA上的mt-nd4，mt-cytb基因以及單拷貝基因actb1進(jìn)行定量。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green mix 10 μL，胚胎DNA 1 μL，正向引物(10 μmol/L) 1 μL，反向引物(10 μmol/L) 1μL，ddH2O 7 μL)反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性10 s, 60 ℃退火10 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95 ℃ 10 s，65 ℃～95 ℃ 0.5 ℃/s升溫。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，數(shù)據(jù)使用Excel 2013，GraphPad Prism 5，Bio-Rad CFX Manager分析和制圖。拷貝數(shù)計(jì)算公式為：

DNA 拷貝數(shù)(copies/μL)=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9) / (DNA堿基數(shù)×660)

單細(xì)胞中DNA拷貝數(shù)=mt-nd4/actb1

2 結(jié)果和分析

2.1 低溫馴化組胚胎低溫發(fā)育能力

如圖1所示，將低溫馴化組TA22斑馬魚(yú)所產(chǎn)的胚胎和未馴化組TE27斑馬魚(yú)胚胎放入22 ℃(半致死溫度)發(fā)育至出膜，TA22斑馬魚(yú)所產(chǎn)的胚胎成活率約為90%，而TE27斑馬魚(yú)所產(chǎn)的胚胎成活率約為60%，二者差異明顯(P<0.01)。同時(shí)將低溫馴化組TA22斑馬魚(yú)所產(chǎn)的胚胎和未馴化組TE27斑馬魚(yú)胚胎放入20 ℃(臨界致死溫度)發(fā)育至出膜，TA22所產(chǎn)的胚胎可以在20 ℃存活，成活率約為50%而TE27斑馬魚(yú)胚胎全部死亡，成活率為0，二者差異顯著(P<0.001)。結(jié)果證明，通過(guò)對(duì)親本的長(zhǎng)期低溫馴化，其所產(chǎn)胚胎的低溫發(fā)育能力增強(qiáng)，且可以突破正常溫度發(fā)育斑馬魚(yú)的臨界致死溫度20 ℃。但隨著發(fā)育溫度的降低，胚胎發(fā)育至出膜的時(shí)間增加。如表2所示，發(fā)育至出膜的時(shí)間隨著溫度的降低而不斷增加。

表2不同溫度斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)間

**：P<0.01，***：P<0.001

圖1低溫處理存活率統(tǒng)計(jì)

Figure 1 Low-temperature treatment survival

2.2 mtDNA拷貝數(shù)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的目的質(zhì)粒為模板，行熒光定量PCR得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn), 每個(gè)梯度(包括平行孔)均有特征性擴(kuò)增曲線(xiàn), 呈明顯的S型; 根據(jù)104～109copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。不同濃度標(biāo)準(zhǔn)定量的模板與Ct值呈直線(xiàn)相關(guān),如圖2-A所示mt-cytb標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=-3.664x+45.314, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù), 相關(guān)系數(shù)為0.999，變異系數(shù)為0.8%。如圖2-B所示mt-nd4基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=-3.615x+43.959, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)，相關(guān)系數(shù)為0.999, 變異系數(shù)為1.6%。如圖2-C所示,單拷貝基因組基因actb1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=-3.862x+43.959, 其中y為Ct值,x為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)，相關(guān)系數(shù)為0.999, 變異系數(shù)為2.1%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3 斑馬魚(yú)0 hpf胚胎mtDNA數(shù)量

通過(guò)對(duì)TE27斑馬魚(yú)0 hpf胚胎和TA22斑馬魚(yú)0 hpf胚胎的mtDNA中2個(gè)不同的線(xiàn)粒體基因的定量發(fā)現(xiàn)(圖3)，TA22斑馬魚(yú)0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約為2.43×104～2.83×104，而TE27斑馬魚(yú)0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約為6.81×106～7.04×106，二者差異明顯(P<0.001)，TE27斑馬魚(yú)0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)約是TA22斑馬魚(yú)0 hpf胚胎的270倍。

2.4 斑馬魚(yú)胚胎線(xiàn)發(fā)育后期mtDNA數(shù)量

通過(guò)對(duì)TE27斑馬魚(yú)8 hpf、12 hpf和24 hpf胚胎和TA22斑馬魚(yú)8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎的mt-nd4基因的定量發(fā)現(xiàn)(圖4)，TE27斑馬魚(yú)8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎單個(gè)細(xì)胞中mt-nd4拷貝數(shù)平均值分別為453、243和150。TA22斑馬魚(yú)8 hpf、12 hpf及24 hpf胚胎單個(gè)細(xì)胞中mt-nd4拷貝數(shù)平均值分別為367、182和83?？梢?jiàn)隨著胚胎的不斷分裂，胚胎中單個(gè)細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)不斷降低，代表著單個(gè)細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)量在不斷減少。同時(shí)，TA22斑馬魚(yú)胚胎中mtDNA拷貝數(shù)仍小于TE27斑馬魚(yú)胚胎，雖然差異仍舊顯著(P<0.001)，但二者的數(shù)目逐漸接近。

圖3 斑馬魚(yú)0 hpf胚胎mtDNA拷貝數(shù)

圖4 斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育后期mtDNA拷貝數(shù)

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的低溫馴化可以使其早期胚胎在低溫下具有更好地發(fā)育能力。在低溫下，馴化組斑馬魚(yú)早期胚胎的存活率與未馴化組斑馬魚(yú)早期胚胎相比顯著增高，同時(shí)，馴化組斑馬魚(yú)胚胎可以突破未馴化組斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的臨界致死溫度。因此可以推測(cè)，溫度馴化對(duì)于魚(yú)類(lèi)早期胚胎的發(fā)育過(guò)程具有重要影響，包括改變?cè)缙谂咛サ牡蜏啬褪苄?，提高其低溫存活率等。目前，低溫馴化影響斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程的具體機(jī)制尚不明確，本研究后續(xù)需要從分子水平上探究魚(yú)類(lèi)低溫馴化以及低溫耐受的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這為深入研究動(dòng)物的進(jìn)化以及生物體環(huán)境之間的關(guān)系提供了有價(jià)值的參考。

胚胎的發(fā)育能力與其線(xiàn)粒體的數(shù)量有著明顯的關(guān)聯(lián)，在合子基因尚未啟動(dòng)的胚胎發(fā)育早期，mtDNA不復(fù)制，胚胎的耗能主要依賴(lài)于卵母細(xì)胞所攜帶的線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體的數(shù)量和卵子發(fā)生以及胚胎發(fā)育阻滯有著密切的聯(lián)系[14]。有研究表明，低水平的線(xiàn)粒體含量有助于卵母細(xì)胞的體外發(fā)育[15]，在小鼠[16]和牛[17]的體外胚胎發(fā)育過(guò)程中的線(xiàn)粒體數(shù)目減少。在胚胎發(fā)育后期，隨著合子基因的啟動(dòng)，跟線(xiàn)粒體復(fù)制和分裂相關(guān)的核基因的表達(dá)，使得線(xiàn)粒體數(shù)量不斷增加，進(jìn)而滿(mǎn)足發(fā)育后期對(duì)能量的需求，使得胚胎能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。隨著發(fā)育溫度的降低，發(fā)育的時(shí)間不斷延長(zhǎng)，發(fā)育至合子基因啟動(dòng)的時(shí)間延長(zhǎng)，但胚胎單位時(shí)間的耗能會(huì)隨著減少，線(xiàn)粒體單位時(shí)間功能減少，相比于馴化組，未馴化組線(xiàn)粒體數(shù)量過(guò)剩。在南極魚(yú)類(lèi)的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫和酸化條件下線(xiàn)粒體具有一定的馴化潛能[18]。線(xiàn)粒體的功能可能在魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)溫度的適應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，低溫會(huì)引起魚(yú)類(lèi)體內(nèi)活性氧ROS(Reactive oxygen species)的相對(duì)增加，進(jìn)一步引起線(xiàn)粒體損傷[19-20]，同時(shí)線(xiàn)粒體也介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[21]。低溫也會(huì)引起細(xì)胞自噬并參與損傷線(xiàn)粒體的清除進(jìn)而減弱細(xì)胞損傷[22]。馴化組胚胎在早期線(xiàn)粒體數(shù)量的減少，可能是胚胎發(fā)育早期能夠耐受低溫并發(fā)育的一個(gè)重要原因。

綜上所述，低溫馴化致使斑馬魚(yú)胚胎mtDNA拷貝數(shù)降低，代表著線(xiàn)粒體數(shù)量的減少。同時(shí)低溫馴化也提高了斑馬魚(yú)胚胎的低溫耐受性，但斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至出膜的時(shí)間延長(zhǎng)。