文/王鶴 王力勇 劉朋 潘秀蓮 王亮 賀加貝

本文通過稀釋法研究大菱鲆對14種抗生素類藥物的耐藥情況，進(jìn)而針對采樣點(diǎn)提出了切實(shí)有效的用藥建議。藥物應(yīng)當(dāng)交替使用，避免長期過量使用造成耐藥，引發(fā)經(jīng)濟(jì)損失。本次數(shù)據(jù)僅限于此采樣點(diǎn)，不能區(qū)域通用。

抗生素作為防治水生動物細(xì)菌病的首選藥物，在大菱鲆弧菌病和愛德華氏菌病的防治中亦有廣泛應(yīng)用。長期、大量使用抗生素極易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致藥物治療失敗，進(jìn)而造成經(jīng)濟(jì)損失。準(zhǔn)確把握病原菌的耐藥性對于細(xì)菌病的有效防治至關(guān)重要，在掌握耐藥現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上根據(jù)其對抗菌藥物的敏感程度和耐藥程度，提出用藥建議可減少因盲目用藥引起的抗生素亂用。在全球減抗限抗大背景下，如何提高用藥針對性和精準(zhǔn)度、減少抗生素類藥物濫用亂用，切實(shí)推進(jìn)基層水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量增效、促進(jìn)漁業(yè)綠色健康發(fā)展需要漁業(yè)相關(guān)部門提供解決方案。

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“動物疫情監(jiān)控與防治（漁業(yè)）——病原菌耐藥性普查”工作安排，試點(diǎn)單位采集山東省煙臺市大菱鲆養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)某生產(chǎn)企業(yè)樣品，分離病原菌、測定菌株耐藥性，在此基礎(chǔ)上提出了精準(zhǔn)施藥建議，為促進(jìn)大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)綠色健康持續(xù)發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

（一）供試菌株的分離鑒定

供試菌株為采集病魚自行分離純化的病原菌。2018年7月～10月每月采集樣品3尾，累計(jì)采樣4次，共計(jì)12尾。每次采集定點(diǎn)養(yǎng)殖場中發(fā)病瀕死或有典型病癥的大菱鲆活體充氧帶回實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天完成病原菌分離。用75%酒精棉球擦拭魚體后，用滅菌剪刀于肛門前端入剪，分離內(nèi)臟器官，選取心、肝、腎、脾等組織或器官用滅菌雙蒸水清洗表面后，劃線接種于選擇性培養(yǎng)基中。根據(jù)病魚外觀癥狀疑似弧菌病的接種于硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）中分離培養(yǎng)，疑似愛德華氏菌病的接種于麥康凱培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（28±1）℃，24h～48h后觀察菌落特征，挑取單菌落接種于腦心浸液培養(yǎng)基（BHIA）分離純化，經(jīng)至少2次純化后得到病原菌株純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物于BHIA斜面保存2份，一份寄上海海洋大學(xué)用于菌株鑒定，一份自留用于藥物敏感性測試。細(xì)菌的鑒定為分子生物學(xué)方法，用16S rDNA保守序列通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）以病原菌株純化物為底物進(jìn)行菌液PCR，經(jīng)測序后進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定分離菌株的種屬。

（二）供試藥物

供試的抗生素類藥物全部由全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供，為粉狀原料藥。藥物分別為：鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、強(qiáng)力霉素、氨芐西林鈉、恩諾沙星、氟苯尼考、硫氰酸紅霉素、交沙霉素、甲砜霉素、鹽酸土霉素，共計(jì)14種。

（三）供試菌株最小抑菌濃度的測定

試驗(yàn)方法為稀釋法。將總站提供的原料藥按照操作規(guī)程方法溶解后，分別用滅菌雙蒸水定容至20mg/mL，作為母液備用。在直徑為12mm的玻璃管中加入MH肉湯培養(yǎng)基，應(yīng)用等倍稀釋法依次設(shè)置10個(gè)藥物梯度，管內(nèi)藥物終濃度依次為100.00μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.20μg/mL。用生理鹽水配置純培養(yǎng)物菌懸液，經(jīng)分光光度計(jì)確定濃度后，分別加于各藥物濃度梯度中，使菌液在各藥物梯度中的終濃度為105個(gè)/mL～106個(gè)/mL。（28±1）℃培養(yǎng)，24h～48h觀察記錄菌株生長情況，以菌液是否渾濁作為判定標(biāo)準(zhǔn)，以抑制菌株生長的最高稀釋度作為該菌株測試藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

（四）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）發(fā)布的藥物敏感性及耐藥性標(biāo)準(zhǔn)對菌株耐藥性進(jìn)行判別。判別標(biāo)準(zhǔn)如下諾氟沙星類、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸土霉素敏感（S）：MIC≤4μg/mL，中敏（I）：MIC=8μg/mL，耐藥（R）：MIC≥16μg/mL；氟苯尼考、甲砜霉素、硫酸新霉素敏感（S）：MIC≤2μg/mL，中敏（I）：MIC=4μg/mL，耐藥（R）：MIC≥8μg/mL；紅霉素敏感（S）：MIC≤0.5μg/mL，中敏（I）：MIC在1μg/mL～4μg/mL之間，耐藥（R）：MIC≥8μg/mL；氨芐西林敏感（S）：MIC≤8μg/mL，中敏（I）：MIC=16μg/mL，耐藥（R）：MIC≥32μg/mL；磺胺類敏感（S）：MIC≤38μg/mL，耐藥（R）：MIC≥76μg/mL。應(yīng)用Excel軟件統(tǒng)計(jì)各供試菌株試驗(yàn)結(jié)果。

圖1 病原菌分離鑒定結(jié)果

菌株敏感率（%）=（敏感菌株數(shù)量÷菌株總數(shù)）×100%

MIC50為抑制50%受試菌株生長所需的最小抑菌濃度；

MIC90為抑制90%受試菌株生長所需的最小抑菌濃度。

二、結(jié)果與分析

（一）養(yǎng)殖場病害、藥物使用及損失情況

7月～10月間，采樣單位未發(fā)生面積超過養(yǎng)殖面積2%以上的大范圍病害，腹水病和腸炎病偶有發(fā)生，發(fā)病率在1%～2%之間。養(yǎng)殖單位發(fā)現(xiàn)患病個(gè)體立即撈出隔離、無害化處理，定期施用氟苯尼考作為預(yù)防性用藥。全年未發(fā)生因病致?lián)p的情況。

（二）病原菌分離鑒定結(jié)果

4次采樣累計(jì)采集大菱鲆病魚12尾用于病原菌分離，共分離純化獲得病原菌37株，經(jīng)上海海洋大學(xué)測序鑒定，最終反饋回28株測序結(jié)果。在測回的28株菌中，弧菌9株（32.14%），包括大菱鲆弧菌8株（28.57%）、大西洋弧菌1株（3.57%）；愛德華氏菌19株（67.86%），均為遲緩愛德華氏菌，見圖1。

（三）菌株對抗菌藥物的感受性

分別用14種供試藥物對分離純化并反饋測序結(jié)果的28株菌進(jìn)行耐藥性測試，各菌株對不同抗生素的感受性結(jié)果詳見表1、2。其中弧菌對鹽酸多西環(huán)素及硫酸新霉素的MIC集中在≤0.20μg/mL；對硫酸新霉素的MIC≤12.5μg/mL，集中在0.20μg/mL左右；對恩諾沙星的MIC介于0.20μg/mL～0.78μg/mL之間；對磺胺類藥物除一株MIC=25μg/mL外，均大于100μg/mL；強(qiáng)力霉素MIC范圍6.25μg/mL～12.5μg/mL；氨芐西林鈉、甲砜霉素MIC≥100μg/mL；氟苯尼考、硫氰酸紅霉素、交沙霉素、鹽酸土霉素MIC集中在50μg/mL～100μg/mL。

表1 弧菌對供試藥物耐受性結(jié)果匯總

表2 遲緩愛德華氏菌對供試藥物耐受性結(jié)果匯總

表3 病原菌對抗菌藥物的敏感性

愛德華氏菌對鹽酸多西環(huán)素MIC介于0.78μg/mL～1.56μg/mL，硫酸新霉素、磺胺類、甲砜霉素MIC≥100μg/mL，強(qiáng)力霉素、氨芐西林鈉MIC集中于6.25μg/mL～12.5μg/mL，恩諾沙星MIC范圍0.78μg/mL～6.25μg/mL，氟苯尼考MIC范圍3.12μg/mL～6.25μg/mL，鹽酸土霉素MIC范圍集中于25μg/mL～50μg/mL。

（四）菌株耐藥率

根據(jù)各菌株對藥物的耐受性結(jié)果，以CLSI相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為判定依據(jù)，對分離菌株的耐藥性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，詳見表3及圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，本次分離的菌株具有較高的耐藥率，在所有測試藥物中僅20.54%的菌株對抗生素類藥物表現(xiàn)為敏感，10.12%的菌株表現(xiàn)中敏，69.34%的菌株耐藥，且菌株有多重耐藥現(xiàn)象，大部分菌株對8種～10種抗生素同時(shí)表現(xiàn)為出耐藥性。其中，弧菌相較于愛德華氏菌耐藥情況更為嚴(yán)重?；【退幘暾既烤瓯壤秊?5.00%，敏菌株占比0.93%；遲緩愛德華氏菌耐藥菌株占66.67%，敏感株占比14.47%。測試結(jié)果顯示分離純化的菌株對磺胺類藥物普遍耐藥，所有菌株在鹽酸土霉素、甲砜霉素、紅敏素、磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶六種藥物中均表現(xiàn)為耐藥。

弧菌耐藥率低于5%的藥物有恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素，MIC90＜0.78μg/mL，此外，硫酸新霉素的耐藥率也相對較低，為11%，MIC90=12.5μg/mL；愛德華氏菌耐藥率低于5%的藥物有恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考和氨芐西林鈉，藥物MIC90均小于12.5μg/mL；盡管愛德華氏菌對氟苯尼考的耐藥率不高，但菌株100%表現(xiàn)為中敏，氨芐西林鈉中敏率也較高（63.16%），這兩種藥在生產(chǎn)中使用不當(dāng)易產(chǎn)生耐藥。大西洋弧菌與大菱鲆弧菌在各類藥物的耐藥性方面并未表現(xiàn)出明顯差異，與大菱鲆弧菌耐藥性基本一致?；【蛺鄣氯A氏菌的菌株耐藥率見圖3、圖4。

圖2 病原菌對抗生素類藥物耐藥率比較

圖3 弧菌菌株耐藥譜型

圖4 愛德華氏菌菌株耐藥譜型

三、用藥建議

綜合試驗(yàn)結(jié)果，該單位分離的病原菌對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素最為敏感，在生產(chǎn)中使用此類藥物會有較好的治療效果，因此推薦恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素作為該單位防治大菱鲆細(xì)菌病的首選藥物。除此之外，硫酸新霉素對弧菌引起的腸炎病可能會有較好的治療效果，氟苯尼考、氨芐西林鈉對遲緩愛德華氏菌引起的腹水病可能有一定的效果?；前奉?、鹽酸土霉素、甲砜霉素、紅敏素等藥物不推薦在生產(chǎn)中使用。

該場以氟苯尼考作為大菱鲆細(xì)菌性疾病防治的首選藥物，定期施用。但根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，病原菌尤其弧菌，對氟苯尼考已經(jīng)產(chǎn)生了一定的耐受性，故氟苯尼考不宜作為腸炎病的防治藥物繼續(xù)施用。對于遲緩愛德華氏菌引起的腹水病來說，氟苯尼考有一定的治療效果，但應(yīng)注意與其他藥物交替使用，避免長期過量使用造成耐藥，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗引發(fā)經(jīng)濟(jì)損失。

對比遼寧省大菱鲆耐藥普查試驗(yàn)結(jié)果，遼寧省分離的病原菌對氨芐西林、甲砜霉素、磺胺類藥物的敏感性測試結(jié)果、耐藥狀況與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致；推薦諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素等作為弧菌病防治首選藥物的防治建議，亦與本試驗(yàn)結(jié)論相似。

但在分離的菌株種類、各菌株對某些藥物耐藥性方面，有不同結(jié)論。與遼寧每月能分離20株～63株弧菌的結(jié)果相比，本采樣點(diǎn)分離的弧菌數(shù)量明顯少，且無季節(jié)變化。不同于遼寧采樣點(diǎn)10℃～17℃的水溫變化，本采樣點(diǎn)大菱鲆養(yǎng)殖用水為深井海水，常年水溫恒定于（17±2）℃，鹽度（28±1），推測該地水質(zhì)狀況較好且指標(biāo)穩(wěn)定，故分離的弧菌數(shù)量較少無明顯季節(jié)變化。由于弧菌為條件性致病菌而愛德華氏菌是真正的病原菌，結(jié)合該單位分離到的遲緩愛德華氏菌較多的情況，提示養(yǎng)殖單位應(yīng)著重防控，避免爆發(fā)大范圍病害。此外，分離到的病原菌對某些藥物的耐受性亦有不同表現(xiàn)。本區(qū)域分離的菌株對氟苯尼考已產(chǎn)生一定耐受性，中敏率較高，而遼寧分離的弧菌對氟苯尼考的耐藥率僅為15.38%。

山東地區(qū)與遼寧地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細(xì)菌性病原菌的耐藥現(xiàn)狀存在共性的同時(shí)亦有差別，該情況與區(qū)域性水質(zhì)狀況、用藥習(xí)慣、采樣單位生產(chǎn)管理水平等多方面因素有關(guān)。

上述數(shù)據(jù)僅限于山東地區(qū)的一個(gè)采樣點(diǎn)，盡管分離到的菌株整體耐藥率較高，但并不能代表山東地區(qū)的整體情況，用藥建議亦不能區(qū)域通用。若要提出更科學(xué)的區(qū)域性用藥建議，應(yīng)在廣泛采集養(yǎng)殖區(qū)域樣本，全面了解病原菌耐藥現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上提出。