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        辛基酚對(duì)萼花臂尾輪蟲毒性效應(yīng)的研究

        2019-10-16 10:02:28李若男王再興夏洋吳建新陸正和
        水產(chǎn)養(yǎng)殖 2019年10期
        關(guān)鍵詞:輪蟲丙酮生殖

        李若男,王再興,夏洋,吳建新,陸正和

        (淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005)

        環(huán)境激素對(duì)人類及動(dòng)物健康的影響已日益引起人們關(guān)注[1]。烷基酚聚氧乙烯醚(APEs)為非離子表面活性劑,廣泛應(yīng)用于洗滌用品、塑料、殺蟲劑等方面,隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,其對(duì)水體的污染日趨嚴(yán)重。辛基酚(Octylphenol,簡稱OP)為APEs的合成原料和主要降解產(chǎn)物,目前在土壤和水體中已有發(fā)現(xiàn),為雌性激素最強(qiáng)的烷基酚類化合物,能夠干擾動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng),對(duì)動(dòng)物生長、發(fā)育和生殖造成危害[2],對(duì)魚類的生殖影響也有報(bào)道[3-5],但OP對(duì)水生浮游動(dòng)物輪蟲的影響未見報(bào)道。

        輪蟲為淡水浮游動(dòng)物的重要組成部分,具有分布廣,繁殖快,生活周期短,易培養(yǎng),為魚類良好的開口餌料。同時(shí)也是水生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的模式動(dòng)物[6]。其中24 h急性毒性和生命表參數(shù)研究為評(píng)價(jià)環(huán)境激素對(duì)輪蟲毒性常用的方法[7-8],同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)輪蟲的有性生殖較無性生殖對(duì)環(huán)境激素敏感,因此利用輪蟲的生殖評(píng)估環(huán)境激素效應(yīng)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[9]。鑒于目前水體中OP污染有加劇趨勢(shì),該文以萼花臂尾輪蟲為受試動(dòng)物,研究OP對(duì)輪蟲主要生殖影響為利用評(píng)價(jià)OP潛在危害提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 輪蟲的來源和培養(yǎng)

        萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus,簡稱輪蟲)采自淮海工學(xué)院校園池塘,挑選單個(gè)孤雌生殖雌體,馴化培養(yǎng)2個(gè)月后,大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)其種群產(chǎn)生休眠卵,以后試驗(yàn)所用的輪蟲為休眠卵孵化而來,孵化使用EPA培養(yǎng)液(96 mg NaHCO3,60 mg CaSO4,60 mg MgSO4和 4 mg KCl,1 L 去離子水),溫度(25±1)℃,光強(qiáng) 200 lx,L∶D=12∶12,時(shí)間 24 h,輪蟲餌料為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa),該藻使用HB-4培養(yǎng)液培養(yǎng),達(dá)到指數(shù)增長期后收集離心,EPA稀釋成所需濃度投喂[10]。

        1.2 OP對(duì)輪蟲急性毒性試驗(yàn)

        試驗(yàn)用 OP(4-tert-octylphenol,分析純 99.0%,Sigma-Aldrich公司),先用丙酮將這種酚類物質(zhì)配成100.0 mg/L母液,然后用EPA將母液稀釋到所需試驗(yàn)濃度,1周用完。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,配制OP濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6和 3.2 mg/L,以上濃度中丙酮濃度不超過(0.2%)另設(shè)丙酮(0.2%)對(duì)照組和空白對(duì)照組。挑選剛孵出的輪蟲幼體20只,放入到容有2 mL測(cè)試液的培養(yǎng)板中,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在(25±1)℃,無光的培養(yǎng)箱中進(jìn)行,24 h后解剖鏡下觀察并記錄每孔中輪蟲死亡數(shù),對(duì)死亡數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件中Probit法計(jì)算OP對(duì)輪蟲24 h的半致死濃度LC50。

        1.3 OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段和產(chǎn)卵量影響

        根據(jù)LC50值,配制 OP濃度為 0.01、0.02、0.04、0.08和 0.16 mg/L(分別約為 LC50的 1/90、1/45、2/45、4/45、8/45),另設(shè)丙酮(0.2%)對(duì)照組和空白對(duì)照組。試驗(yàn)開始時(shí),取剛孵出的輪蟲幼體(<2 h)1個(gè)接入容有1 mL以上測(cè)試液(內(nèi)含0.5×106cells/mL小球藻)的細(xì)胞培養(yǎng)板中,為防藻類和輪蟲沉底,每6 h懸浮試管底部藻液,試驗(yàn)開始的48 h,每隔3~4 h觀察1次,記錄輪蟲首次產(chǎn)卵及產(chǎn)幼時(shí)間,最后1次產(chǎn)卵時(shí)間和產(chǎn)幼時(shí)間并記錄輪蟲產(chǎn)卵數(shù),及時(shí)移去新生的幼體,每隔24 h更換1次培養(yǎng)液,各測(cè)試組重復(fù)5次,試驗(yàn)至全部個(gè)體死亡為止[11]。

        1.4 OP對(duì)輪蟲2 d的r和7 d休眠卵產(chǎn)卵影響

        取剛孵出的輪蟲幼體6個(gè),接入到含有12 mL以上測(cè)試液的14 mL的試管中(內(nèi)含3.0×106ells/mL小球藻),每6 h懸浮試管底部藻液,2 d后將試管中輪蟲倒入培養(yǎng)皿中統(tǒng)計(jì)輪蟲數(shù)量,統(tǒng)計(jì)后將所有輪蟲全部移入原來試管中繼續(xù)培養(yǎng),7 d后統(tǒng)計(jì)輪蟲休眠卵的數(shù)量,休眠卵數(shù)量包括攜有性雌體所攜的休眠卵,試驗(yàn)設(shè)丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組,每組設(shè)5個(gè)重復(fù),試驗(yàn)在溫度(25±1)℃,黑暗中進(jìn)行[12-13]。

        1.5 相關(guān)參數(shù)的定義和分析方法

        各主要發(fā)育階段:胚胎發(fā)育期(指從卵產(chǎn)出到幼體孵出所經(jīng)歷的時(shí)間);繁殖期(幼體孵出到產(chǎn)第1枚卵所經(jīng)歷時(shí)間);繁殖期(指從第1枚卵產(chǎn)出到最后1枚卵產(chǎn)出經(jīng)歷時(shí)間)。

        平均壽命(繁殖前期、繁殖期、繁殖后期之和);r:種群增長率(population growth rate):r=(lnNt-lnN0)/t,Nt和N0分別為試驗(yàn)經(jīng)過t天和試驗(yàn)開始時(shí)的種群數(shù)量,t=2 d;休眠卵產(chǎn)量(resting egg production,RE):輪蟲在7 d內(nèi)所產(chǎn)的休眠卵數(shù)量。

        對(duì)試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA),對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異的與對(duì)照組相比進(jìn)行Dunnett's分析,使用sigmaplot 11.0作圖和數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 OP對(duì)輪蟲24 h急性毒性

        24 h急性毒性下丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組中輪蟲病死率分別為5.0%與3.75%,經(jīng)t檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05),因此可得出該試驗(yàn)中丙酮添加對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響。通過空白對(duì)照組進(jìn)行LC50計(jì)算,OP濃度對(duì)數(shù)與病死率關(guān)系見圖1。從圖1中可以看出,24 h急性毒性試驗(yàn)中,輪蟲病死率隨著OP 的濃度增加而上升,OP 濃度0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2mg/L下,輪蟲病死率分別為8.75%、23.75%、42.5%、65.0%和92.5%,通過Probit計(jì)算方程Y=2.14X+0.214,(Y 概率值,X 為濃度對(duì)數(shù)),LC50為 0.91 mg/L,95%置信限為 0.66~1.27 mg/L。

        圖1 OP濃度對(duì)數(shù)與病死率關(guān)系

        2.2 OP對(duì)輪蟲主要生活階段和產(chǎn)卵量影響

        OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段歷時(shí)和產(chǎn)卵量影響見表1。從表1中可以看出,丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組之間對(duì)輪蟲的生殖前期、生殖期、生殖后期、平均壽命及產(chǎn)卵量無顯著影響(P>0.05),而OP顯著影響以上指標(biāo)(P<0.05)。與對(duì)照組相比,OP濃度在0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖前期、生殖期、生殖后期和平均壽命(P<0.05),其他濃度無顯著影響(P>0.05),OP濃度在0.04 mg/L顯著降低輪蟲的生殖量(P<0.05),而以上測(cè)試濃度對(duì)輪蟲胚胎發(fā)育無影響(P>0.05)。

        表1 OP對(duì)輪蟲主要發(fā)育階段歷時(shí)和產(chǎn)卵量影響

        2.3 OP對(duì)輪蟲2 d生殖參數(shù)影響

        試驗(yàn)顯示丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照(0 mg/L)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05),但空白對(duì)照組與濃度為0.08和0.16 mg/L輪蟲2 d的r具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P<0.05)。OP對(duì)輪蟲2 d的r影響情況見圖2。對(duì)OP與r值效應(yīng)關(guān)系,從圖2中可以通過Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope得到很好擬合,得出曲線為Y=0.49+(0.825-0.49)/(1+(x/EC50)-3.82,半效應(yīng)濃度 EC50為0.053 mg/L。

        圖2 OP對(duì)輪蟲2 d的r影響

        2.4 OP對(duì)萼花臂尾輪蟲7 d的休眠卵影響

        OP對(duì)輪蟲7 d的休眠卵影響見圖3。從圖3中可以看出,OP濃度對(duì)輪蟲7 d的休眠卵產(chǎn)量具有顯著影響(P<0.05),從濃度為 0.01~0.16 mg/L,輪蟲7 d所產(chǎn)休眠卵產(chǎn)量平均分別為 21.4、11.4、12.2、6.8 和4.4個(gè),而丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組休眠卵產(chǎn)卵分別為 32.6和 30.2個(gè),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05),而其他濃度組所產(chǎn)休眠卵產(chǎn)量與空白對(duì)照組相比呈顯著下降(P<0.05),對(duì)濃度與休眠卵產(chǎn)量效應(yīng)關(guān)系,利用Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope擬合,得出曲線為Y=3.78+(30.35-3.78)/(1+(x/EC50)-1.22,EC50為 0.014 mg/L。

        圖3 OP對(duì)輪蟲7 d的休眠卵影響

        3 討論

        3.1 OP對(duì)輪蟲的24 h急性毒性

        OP為烷基酚類化合物中具有代表性的環(huán)境雌激素,有關(guān)其對(duì)水生動(dòng)物的急性毒性影響已有報(bào)道,如OP對(duì)泥鰍 24的LC50分別為 3.27 mg/L[14],對(duì)中國林蛙蝌蚪的LC50為0.73 mg/L[15]。該研究顯示OP對(duì)輪蟲24 h的LC50為0.91 mg/L,因此利用輪蟲24 h急性毒性評(píng)價(jià)OP明顯比泥鰍24 h毒性急性敏感,但敏感性低于中國林蛙。

        3.2 OP對(duì)輪蟲主要生活階段和生殖量影響

        由于OP對(duì)水生動(dòng)物的生長、發(fā)育和生殖具有潛在的毒性作用,因此利用水生動(dòng)物上述指標(biāo)評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。如劉正濤等研究了OP對(duì)大型溞21 d的生殖影響,發(fā)現(xiàn)OP濃度0.08 mg/L能降低大型溞的生殖量降低,增加溞類后代中雄性比例[16];OP濃度0.45 mg/L能降低日本青鳉卵孵化率,使魚鰾發(fā)育異常[17];OP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育72 h的半效應(yīng)濃度為0.5 mg/L[18]。

        與魚類等動(dòng)物相比,輪蟲具有個(gè)體小,生命周期短,易培養(yǎng)、對(duì)毒物敏感強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),因此在評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)方面具有一定優(yōu)勢(shì)。該研究結(jié)果顯示,OP濃度0.08、0.16 mg/L雖對(duì)輪蟲胚胎發(fā)育無影響,但對(duì)個(gè)體的成熟(生殖前期延長)、生殖生殖期及壽命都具有抑制作用,徐曉平等研究溴氰菊酯對(duì)萼花臂尾輪蟲生殖時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果,其推測(cè)生殖前期的延長可能是導(dǎo)致輪蟲種群增長下降的主要原因[19]。

        OP濃度0.02 mg/L時(shí)顯著延長輪蟲的生殖期,但濃度0.08、0.16 mg/L顯著降低輪蟲生殖期、壽命、生殖量,推測(cè)輪蟲可能在OP低劑量脅迫下對(duì)生殖、壽命與生殖量之間進(jìn)行生態(tài)策略的權(quán)衡,但在高劑量毒性作用下,輪蟲對(duì)以上權(quán)衡指標(biāo)被破壞,使得上述指標(biāo)下降。該研究顯示輪蟲生殖量比生活階段歷時(shí)在評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)具有較高的敏感性,因此,輪蟲生殖量為評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)具有一定優(yōu)勢(shì)。

        3.3 OP對(duì)輪蟲2 d的r值影響

        魚類的卵黃原蛋白(VTG)常作為評(píng)價(jià)污染物具有環(huán)境雌激素效應(yīng)的標(biāo)記物之一。吳翠琴等[3]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.02 mg/L能夠顯著誘導(dǎo)真鯛幼魚產(chǎn)生VTG,宮向紅等[4]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.01 mg/L能誘導(dǎo)鯉魚幼魚產(chǎn)生VTG,而該濃度對(duì)魚的生存率、性腺指數(shù)沒有變化。雷忻等[20]研究發(fā)現(xiàn)OP濃度0.12 mg/L能夠誘導(dǎo)泥鰍雄魚產(chǎn)生VTG,而該濃度對(duì)泥鰍肝臟的SOD、CAT無顯著影響,該研究顯示輪蟲暴露在OP濃度0.08 mg/L下2 d的r顯著下降,利用輪蟲2 d的r評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)時(shí)其敏感性明顯低于真鯛和鯉魚,但高于泥鰍。Snell等也認(rèn)為輪蟲2 d的生活周期測(cè)試評(píng)價(jià)毒物敏感性高于24 h急性毒性LC50值,該研究顯示輪蟲2 d的r的EC50為0.053 mg/L,明顯低于24 h的LC50為0.92 mg/L。

        3.4 OP對(duì)輪蟲7 d休眠卵產(chǎn)量影響

        輪蟲休眠卵為有性生殖的最終產(chǎn)物,其形成受溫度、鹽度、污染物等因素影響。Preston等[21]研究表明,萼花臂尾輪蟲種群暴露在PCP濃度0.0025 mg/L和Cu2+濃度0.005 mg/L下其4 d休眠卵產(chǎn)量與對(duì)照組相比顯著下降,但上述濃度對(duì)輪蟲病死率、游泳行為、種群增長、混交率等指標(biāo)卻無顯著變化。輪蟲種群暴露在二嗪農(nóng)、殺螟硫磷等農(nóng)藥下7 d休眠卵產(chǎn)量也與出現(xiàn)類似現(xiàn)象[22],對(duì)此Snell等[13]研究認(rèn)為輪蟲休眠卵產(chǎn)量為評(píng)價(jià)環(huán)境激素效應(yīng)最敏感的指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示OP濃度0.01 mg/L能顯著降低輪蟲7 d的休眠卵產(chǎn)量,顯示輪蟲7 d休眠卵產(chǎn)量評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)比輪蟲生殖階段指標(biāo)敏感、2 d的r敏感,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該濃度比泥鰍,真鯛誘導(dǎo)VTG所需的OP濃度要低[3],因此輪蟲休眠卵產(chǎn)量在評(píng)價(jià)OP環(huán)境激素效應(yīng)方面具有操作簡單,費(fèi)用較少等優(yōu)點(diǎn)。

        綜上所述,水體中OP超過一定濃度會(huì)干擾輪蟲的生殖,最終會(huì)影響輪蟲的種群數(shù)量變化,其種群變化及OP通過食物鏈傳遞可能會(huì)對(duì)魚類的生長、發(fā)育及生殖產(chǎn)生影響,因此有必要對(duì)水體中OP進(jìn)行監(jiān)控,防止其對(duì)水體的進(jìn)一步污染。

        颶風(fēng)多里安致加拿大貝類養(yǎng)殖業(yè)受災(zāi)

        2019年9月8日,大西洋颶風(fēng)多里安(Dorian)橫掃北美,在加拿大沿海地區(qū)制造100 mm強(qiáng)降水,加拿大海洋漁業(yè)局通知,愛德華王子島、新斯科舍省和新不倫瑞克省的貝類收成要暫停一周以上。

        漁業(yè)局稱,食用被污染的貝類可能造成嚴(yán)重的疾病甚至死亡,即便高溫煮熟也不能降解毒素。

        新斯科舍水產(chǎn)養(yǎng)殖協(xié)會(huì)主席Tom Smith表示,颶風(fēng)多里安使該地區(qū)多處牡蠣、貽貝、蛤蜊、扇貝和海藻的養(yǎng)殖遭遇損失,尤其是牡蠣養(yǎng)殖業(yè),受損率達(dá)到了50%以上。2018年,新斯科舍水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)收入超過1.2億加元。

        加拿大媒體CBC報(bào)道,颶風(fēng)過后幾十家愛德華王子島貽貝和牡蠣養(yǎng)殖戶的災(zāi)后清理活動(dòng)持續(xù)了一周,目前還無法估算損失額。該地區(qū)擁有130家貽貝養(yǎng)殖場(chǎng),年產(chǎn)量18 600 t,占加拿大產(chǎn)量的80%,產(chǎn)值約6 000萬加幣;牡蠣養(yǎng)產(chǎn)量約907 184.74 kg,產(chǎn)值200萬加元。

        (www.shuichan.cc)

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