張海旺，陳禮剛，張 苓，王藝明，孫素影，張海霞，周長(zhǎng)臣，鄭新安，李修龍，李 松

腦出血(intracerebral hemorrhage；ICH)是致殘率和致死率較高的卒中類疾病，發(fā)病后1 m內(nèi)的病死率高達(dá)30%～50%，幸存者通常伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失等后遺癥，每年全球約有新發(fā)200萬(wàn)ICH患者[1]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效治療措施，出血性腦損傷不僅是血腫本身的占位效應(yīng)和血腫周圍組織直接破壞的原發(fā)性損傷，繼發(fā)性腦損傷也扮演著重要的角色。本研究探討環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A；CsA)早期應(yīng)用能夠改善ICH大鼠的神經(jīng)功能缺陷，提高ICH大鼠的生活質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠96只，體重260 g～280 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、腦出血+溶劑組(ICH+Vehicle)、腦出血+CsA 5 mg組(ICH+CsA 5 mg)和腦出血+CsA 10 mg(ICH+CsA 10 mg)共4組，每組各24只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 碘化丙啶染色(PI)細(xì)胞核熒光染料購(gòu)自美國(guó)ABcam公司；伊文思藍(lán)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；CsA購(gòu)自美國(guó)安迪生物R&D Systems。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 腦立體定位儀(淮北正華生物儀器公司)；透射電子顯微鏡Hitachi-7500(日本HITACHI公司)；BX41型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及給藥方式 采用動(dòng)物腦立體定向自體血腦內(nèi)注入法，SD雄性大鼠均經(jīng)10%水合氯醛(4 ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，動(dòng)物俯臥固定于立體定位儀上，頭部備皮消毒后，正中矢狀切開(kāi)，切口長(zhǎng)約1.0 cm，充分暴露前囟，前囟右旁3.5 mm、前0.2 mm處用牙科鉆鉆一直徑約1 mm小孔，微量注射器抽取右股動(dòng)脈血100 μl，沿孔道垂直進(jìn)針5.5 mm后，注入100 μl自體血，縫合頭部后縫合右股部，回籠飼養(yǎng)，假手術(shù)組只進(jìn)針不注血。腦出血+溶劑組、腦出血+CsA 5 mg組、腦出血+CsA 10 mg大鼠于術(shù)后15 min分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水、CsA 5 mg/kg、CsA 10 mg/kg，觀察時(shí)間超過(guò)24 h，每天給藥1次。

1.2.2 電鏡檢測(cè) SD雄性大鼠術(shù)后24 h，10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射大鼠麻醉，打開(kāi)胸腔暴露心臟，剪開(kāi)右心房，左心室灌注150 ml生理鹽水，4%多聚甲醛和1%戊二醛350 ml～400 ml固定；快速將待檢部位的腦組織用鋒利潔凈的雙面刀片修切成大小1 mm3待檢組織塊；快速將待檢組織塊放入4%戊二醛固定液4℃固定2 h；0.1 mol/LPBS清洗3次；經(jīng)1%四氧化鋨固定2 h；常規(guī)乙醇及丙酮梯度脫水；環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、聚合；制備0.5 μm厚度半薄切片光鏡定位后在制備60 nm厚度超薄切片；醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色；行透射電子顯微鏡Hitachi-7500觀察神經(jīng)元及線粒體情況。

1.2.3 腦水含量測(cè)定 術(shù)后24 h處死大鼠，迅速斷頭取腦，取血腫周圍腦組織于分析天平稱濕重，測(cè)重精確到0.1 mg。置烤箱于110 ℃下烘烤24 h取出，根據(jù)Elliott公式(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.4 血腦屏障通透性檢測(cè) 術(shù)后24 h時(shí)經(jīng)股靜脈注入2%EB溶液(5 ml/kg)1 h后，打開(kāi)胸腔暴露心臟，通過(guò)左心室灌注生理鹽水，剪開(kāi)右心耳，直到右心耳流出的液體為清亮為止，迅速斷頭取腦，清洗腦表面雜質(zhì)，濾紙吸干腦表面水分，取血腫周圍腦組織，稱濕重后置入PBS溶液中研磨，15000 r/min離心30 min，取1 ml上清，加入等體積三氯乙酸乙醇(1∶3)溶液，于4 ℃過(guò)夜孵育后，再于4 ℃下15000 r/min離心30 min，取上清液采用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)定為620 nm，計(jì)算EB的含量。

1.2.5 PI染色 術(shù)后24 h，動(dòng)物麻醉后仰臥固定，取自體血與PI溶液2 μl混勻，快速注入心臟10 min，開(kāi)胸暴露心臟，從左心室把尖端磨平的16號(hào)針頭插至主動(dòng)脈根部，用絲線結(jié)扎，防止脫落，剪開(kāi)右心耳放血。生理鹽水沖洗至流出液變澄清為止，再以4 ℃的4%多聚甲醛溶液灌注固定。當(dāng)肢體變硬，肢端及尾部的震顫消失時(shí)終止灌注。將腦置于4 ℃上述固定液中避光固定24 h，取出放入30%蔗糖中避光脫水，冰凍切片，片厚10 μm，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 行為學(xué)評(píng)分 術(shù)后72 h，采用Hua等[2]評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，每只大鼠均進(jìn)行前肢放置反射試驗(yàn)(Forelimb Placing Score)、前肢使用不對(duì)稱試驗(yàn)(Forelimb Use Asymmetry Score)、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)(Corner turn Score)等3項(xiàng)神經(jīng)功能測(cè)評(píng)。分值越高代表神經(jīng)功能損害越輕，反之損傷越重。

2 結(jié) 果

2.1 腦水腫觀察和腦水含量檢測(cè) 術(shù)后24 h電鏡觀察，ICH+Vehicle組血腫周圍腦組織線粒體腫脹較Sham組明顯，ICH+CsA 10 mg組血腫周圍組織線粒體腫脹較ICH+Vehicle組、ICH+CsA 5 mg組輕，ICH+CsA 5 mg組血腫周圍腦組織線粒體腫脹較ICH+Vehicle組輕(見(jiàn)圖1)。術(shù)后24 h腦水含量檢測(cè)，ICH+Vehicle組(79.32±0.17)血腫周圍腦組織腦水含量較Sham組(77.55±0.12)高(P<0.05)，ICH+CsA 10 mg組(78.57±0.06)血腫周圍組織腦水含量顯著較ICH+Vehicle組、ICH+CsA 5 mg組(78.96±0.10)低(P<0.05)，ICH+CsA 5 mg組血腫周圍腦組織腦水含量顯著較ICH+Vehicle組降低(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

2.2 血腦屏障通透性檢測(cè) 術(shù)后24 h，ICH+Vehicle組(5.53±0.26)血腫周圍腦組織血腦屏障破壞程度較Sham組(2.55±0.13)顯著增高(P<0.05)，ICH+CsA 10 mg組(3.24±0.16)血腫周圍腦組織血腦屏障破壞程度較ICH+Vehicle組、ICH+CsA 5 mg組(4.12±0.12)顯著降低(P<0.05)，ICH+CsA 5 mg組血腫周圍腦組織血腦屏障破壞程度較ICH+Vehicle組顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

2.3 壞死細(xì)胞計(jì)數(shù) 術(shù)后72 h PI染色計(jì)數(shù)，ICH+CsA 10 mg組(69.33±11.31)血腫周圍組織壞死細(xì)胞數(shù)顯著較ICH+Vehicle組(399.00±12.43)、ICH+CsA 5 mg組(97.00±8.99)減少(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.4 神經(jīng)功能評(píng)分 術(shù)后72 h 3項(xiàng)神經(jīng)功能測(cè)評(píng)方法的結(jié)果均提示：假手術(shù)組較ICH+Vehicle、ICH+CsA 5 mg、ICH+CsA 10 mg神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高(P<0.05)，ICH+Vehicle較ICH+CsA 5 mg、ICH+CsA 10 mg神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)圖5)。

圖1 術(shù)后24 h電鏡掃描，A：Sham組；B：ICH+Vehicle組；C：ICH+CsA 5 mg組；D：ICH+CsA 10 mg組

圖2 術(shù)后24 h腦水含量變化示意圖，ICH+Vehicle組顯著較對(duì)照組高，藥物處理組顯著較ICH+Vehicle組低。#號(hào)代表兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖3 術(shù)后24 h伊文思藍(lán)變化示意圖，ICH+Vehicle組顯著較Sham組差，藥物處理組顯著較ICH+Vehicle組佳。#號(hào)代表兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖4 術(shù)后72 h PI染色示意圖及結(jié)果示意圖，A：Sham組；B：ICH+Vehicle組；C：ICH+CsA 5 mg組；D：ICH+CsA 10 mg組；A、B、C、D黑色箭頭指示壞死細(xì)胞。藥物處理組顯著較ICH+Vehicle組壞死細(xì)胞少。**號(hào)代表兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦出血早期，血腫周圍腦組織含水量顯著增加、血腦屏障顯著破壞、壞死細(xì)胞顯著增多，導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低；而在腦出血后CsA早期應(yīng)用能夠降低腦組織含水量、改善血腦屏障通透性、抑制細(xì)胞壞死、從而改善大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分。這些結(jié)果表明，CsA早期應(yīng)用能夠減輕血腫周圍腦組織的受損程度，改善大鼠腦出血后的生活質(zhì)量。

在大鼠腦出血實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞壞死在早期腦損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。腦損傷早期壞死會(huì)涉及腦細(xì)胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)和腦血管(平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)的改變[4]。本實(shí)驗(yàn)在腦出血早期血腫周圍腦組織中觀察到細(xì)胞壞死的現(xiàn)象(見(jiàn)圖4)，PI染色發(fā)現(xiàn)腦出血+溶劑組血腫周邊細(xì)胞壞死細(xì)胞顯著增加，CsA早期應(yīng)用后能夠顯著減少壞死細(xì)胞數(shù)，其中腦出血+CsA 10 mg組減輕效應(yīng)較腦出血+CsA 5 mg組更明顯，表明細(xì)胞壞死與早期腦損傷有密切聯(lián)系。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中。細(xì)胞壞死程度和腦水腫被視為腦出血預(yù)后不佳的兩個(gè)主要因素[5]。本實(shí)驗(yàn)中腦出血+溶劑組術(shù)后24 h血腫周圍腦水腫明顯加重、腦組織含水量顯著增加、血腦屏障通透性顯著破壞[6]。而CsA早期應(yīng)用能夠顯著減輕腦水腫、降低腦組織含水量、改善血腦屏障通透性，其中腦出血+CsA 10 mg組減輕腦水腫、降低腦組織含水量、改善血腦屏障破壞的作用均較腦出血+CsA 5 mg組更明顯(見(jiàn)圖2、圖3)，即高劑量組能夠達(dá)到更佳的治療效果。

圖5 前肢放置反射試驗(yàn)(F=18.92，P=0.00)；前肢使用不對(duì)稱試驗(yàn)(F=117.210，P=0.00)；轉(zhuǎn)角試驗(yàn)(F=116.960，P=0.00)

CsA通過(guò)結(jié)合細(xì)胞親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D；CYPD)抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放，阻止誘導(dǎo)凋亡因子核轉(zhuǎn)位而誘發(fā)染色質(zhì)凝集、變性、壞死，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。因此，這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件發(fā)生，腦實(shí)質(zhì)和腦血管的壞死，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死[7]。本實(shí)驗(yàn)電鏡觀察ICH后血腫周圍腦組織神經(jīng)元中線粒體明顯腫脹(見(jiàn)圖1)，CsA早期應(yīng)用后，治療組線粒體腫脹程度顯著減弱，但高劑量組仍優(yōu)于低劑量組，表明CsA可能還具有劑量依賴性的相關(guān)特性的特點(diǎn)[8]。

CsA作為線粒體靶向保護(hù)劑，不同于其他凋亡和壞死抑制劑，它能夠直接結(jié)合CypD。CypD是位于線粒體mPTP的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子，可能是細(xì)胞壞死下游的一個(gè)靶點(diǎn)分子[9]。CsA通過(guò)結(jié)合CypD抑制mPTP開(kāi)放，從而維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，保護(hù)線粒體膜的完整性[10，11]，抑制壞死相關(guān)蛋白釋放從而抑制細(xì)胞壞死，進(jìn)而降低血腦屏障通透性，改善腦水腫和神經(jīng)行為缺陷，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究表明CsA早期應(yīng)用能夠減輕實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦水腫，改善血腦屏障通透性，抑制細(xì)胞壞死，改善神經(jīng)功能評(píng)分。CsA對(duì)腦出血后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，可能是CsA通過(guò)結(jié)合CypD抑制mPTP的開(kāi)放，阻止神經(jīng)細(xì)胞壞死。隨著對(duì)這一機(jī)制進(jìn)一步深入的研究，相信對(duì)腦出血改善早期腦損傷帶來(lái)新的希望。