李 磊 周 密 許 俊 倪正義

武漢市金銀潭醫(yī)院胸外科(武漢 430000)

肺癌是癌癥死亡的主要原因之一，每年約160萬患者因肺癌死亡。隨著低劑量CT等影像技術(shù)的發(fā)展，早期肺癌檢出率逐步提高，但仍有約65%的肺癌患者于診斷時處于疾病中晚期[1]。中晚期肺癌患者常失去手術(shù)機(jī)會, 5年生存率不足15%[2]。迫切需要尋找新的肺癌診斷血清生物標(biāo)志物，對肺癌進(jìn)行及時診斷，以便盡早干預(yù)，改善肺癌患者生存率[3]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)是一組鋅和鈣依賴性酶，結(jié)構(gòu)相似，主要功能為降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白，其與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。腫瘤細(xì)胞常誘導(dǎo)MMPs過表達(dá)，降解周圍基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs可介導(dǎo)與細(xì)胞遷移、分化、增殖、凋亡、血管生成和炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞惡變而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[5]。MMPs的活性和功能主要由四種組織抑制金屬蛋白酶 (tissue inhibitors of metalloproteinases1- 4，TIMP1- 4)控制[6]。MMPs和TIMPs平衡紊亂可導(dǎo)致不受控制ECM轉(zhuǎn)換、炎癥瀑布反應(yīng)及細(xì)胞生長和遷移失控，創(chuàng)造有利于腫瘤發(fā)生的微環(huán)境[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織MMP-9表達(dá)增加，與癌細(xì)胞惡性潛能、癌癥進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是預(yù)后的分子標(biāo)志物[8]。盡管如此，非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)中MMPs和TIMPs濃度尚不清楚，本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)中MMP-9和TIMP-1濃度，并評估其診斷效能。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

選取2016年1月—2018年12月期間于我院就診的新診斷的非小細(xì)胞肺癌患者80例，其中男52 例，女28例, 年齡 (63.71±10.62)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：① 經(jīng)痰細(xì)胞學(xué)、細(xì)針穿刺、支氣管鏡及胸部CT建立初步診斷，并最終經(jīng)病理學(xué)確診的非小細(xì)胞肺癌患者；② 病理學(xué)診斷治療來自于細(xì)針穿刺標(biāo)本或手術(shù)后病理標(biāo)本；③ 新診斷的肺癌患者；④ 診斷前未行放療、化療及細(xì)胞免疫治療。剔除標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床病理、檢驗(yàn)治療不全者；② 隨訪資料不全者；③ 不同意入組研究的患者。本研究征得患者同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 病例分組

本研究最終入組80例非小細(xì)胞肺癌患者，為NSCLC組，其中腺癌42例，鱗癌38例，男52例，女28例；選取同時期在我院行常規(guī)體檢的健康人群30例為健康對照組，其中男49 例，女31例，年齡 (60.11±12.09)歲。收集兩組患者性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移治療。兩組研究對象在年齡、性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.3 標(biāo)本采集和檢測

采集患者清晨空腹外周血5 mL，在-4℃下以1 500×g離心10min。將上清液儲存在-80℃冰箱以備統(tǒng)一檢測。采集樣品采用ELISA檢測試劑盒(美國sigma公司)檢測，其中血清MMP-9和TIMP-1 濃度最低檢測值分別為0.01 ng/mL和0.01 ng/mL，前者組間和組內(nèi)變異系數(shù)分別為3.5%和4.6%, 后者為3.0%和4.7%。采用德國羅氏公司的ELECYS 2010 型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析測定儀檢測CEA濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組和健康對照組血清MMP-9、TIMP-1和CEA濃度比較

NSCLC組血清MMP-9濃度高于健康對照組[(302.92±109.54)vs(136.14±70.43)/P<0.05]；血清TIMP-1濃度高于健康對照組[(161.65±50.38)vs(130.45±60.34)/P<0.05], NSCLC組血清CEA濃度高于健康對照組(P<0.05)，見表1。

表1NSCLC組和健康對照組血清MMP-9、TIMP-1和CEA濃度比較

2.2 不同臨床特征的NSCLC患者血清MMP-9和TIMP-1濃度比較

TNM(III+IV)期患者血清MMP-9濃度高于(I+II)期患者,(P=0.005)； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者M(jìn)MP-9濃度高于陰性患者(P=0.008)；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者血清MMP-9濃度高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P=0.003)，血清MMP-9濃度在NSCLC患者不同年齡、性別和組織學(xué)類型上無差異(P值均>0.05)；血清TIMP-1濃度在NSCLC患者不同年齡、性別、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移上均無差異(P>0.05),見表2 。

表2不同臨床病理特征NSCLC患者血清MMP-9和TIMP-1濃度比較

注：P1, MMP-9濃度比較；P2, TIMP-1濃度比較

2.3 血清MMP-9、TIMP-1 和CEA對NSCLC的診斷價值

ROC曲線示：當(dāng)截?cái)嘀禐?70.92 ng/mL時，MMP-9診斷NSCLC曲線下面積(AUC)為0.843 (95% CI：0.788- 0.937,P<0.001)，靈敏度和特異度分別為65.7%、88.0%；當(dāng)截?cái)嘀禐?40.3 ng/mL時，TIMP-1的AUC為0.611(95% CI: 0.593- 0.681,P<0.01)，靈敏度和特異度分別為59.4%、71.0%；當(dāng)截?cái)嘀禐?.4 ng/mL時， CEA的AUC為 0.775(95% CI: 0.683～0.868，P<0.001),靈敏度和特異度分別為54.7%、87.0%；三者聯(lián)合使用診斷NSCLC的AUC為0.912 (95% CI：0.888～0.967，P<0.001), 靈敏度和特異度為85%和92%，見圖1、表3。

表3血清MMP-9、TIMP-1、CEA及聯(lián)合應(yīng)用對NSCLC的診斷效能比較

圖1 三種血清標(biāo)志物診斷非小細(xì)胞肺癌ROC曲線

3 討 論

我國肺癌發(fā)病率呈逐年增加趨勢，鑒于肺癌早期癥狀缺乏特異性，常起病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)肺癌患者診斷時常處于中晚期，部分患者失去手術(shù)治療機(jī)會，導(dǎo)致其預(yù)后不佳。肺癌的診斷主要依靠細(xì)胞病理學(xué)和影像學(xué)檢查，現(xiàn)有腫瘤生物標(biāo)志物對肺癌診斷特異性較低，尋找與腫瘤相關(guān)的分子標(biāo)志物是近年來研究熱點(diǎn)[10]。

腫瘤發(fā)生是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程。過去研究認(rèn)為基因突變、腫瘤干細(xì)胞突變和細(xì)胞增殖失控為主要原因，最近認(rèn)為腫瘤微環(huán)境也在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7,11]。MMP-9和TIMP-1是ECM重要的一組互相拮抗蛋白。前者破壞ECM成分，后者抑制MMP-9的活性和功能。MMP-9和TIMP-1與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其裂解ECM結(jié)構(gòu)組分，構(gòu)建腫瘤生長和擴(kuò)增空間，并有利于腫瘤突破基底膜向遠(yuǎn)處播散。最近研究顯示，除上述功能外，MMP-9和TIMP-1還能調(diào)節(jié)生長因子和受體、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞粘附分子網(wǎng)絡(luò)，參與癌癥發(fā)生和進(jìn)展重要過程：如細(xì)胞生長、凋亡、腫瘤血管生成和逃避免疫監(jiān)視[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)在新診斷的非小細(xì)胞肺癌患者中，血清MMP-9和TIMP-1濃度較健康對照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩者可能為診斷肺癌潛在輔助非侵入性血清標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道MMP-9和TIMP-1蛋白在非小細(xì)胞肺癌和其他癌癥組織中均觀察到不同程度表達(dá)增加[13]，但在血液循環(huán)中MMP-9和TIMP-1濃度報(bào)道甚少。Bigbee[14]等人在評估健康人群、肺纖維化患者和NSCLC血漿70種蛋白差異時，其發(fā)現(xiàn)MMP-9濃度較健康人群和肺纖維化患者均顯著性增高，TIMP-1濃度和健康者比較增加，但是和肺纖維化患者無顯著性差異, 與本研究結(jié)果一致。

本研究進(jìn)一步評估MMP-9濃度和NSCLC患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，淋巴結(jié)陽性NSCLC患者血清MMP-9濃度高于淋巴結(jié)陰性者，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清MMP-9濃度高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者, 提示其與患者疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。TNM分期(III+IV期)患者血清MMP-9濃度高于(I+II期)患者，提示其與患者疾病階段有關(guān)。以上結(jié)果均提示血清MMP-9可能是NSCLC患者腫瘤進(jìn)展的重要標(biāo)志物。本研究并未發(fā)現(xiàn)TIMP-1濃度在不同的淋巴結(jié)狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期之間的差異，結(jié)果與最近報(bào)道一致[15]。在NSCLC患者分析多種與細(xì)胞外基質(zhì)平衡血清蛋白時，并未發(fā)現(xiàn)TIMP-1與NSCLC腫瘤分期相關(guān)性?？紤]到先前研究[14]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清總體TIMP-1高于健康對照組，結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)其作為MMP-9重要的抑制劑，與NSCLC臨床參數(shù)并無相關(guān)性。可能的原因如下：① 由于NSCLC患者機(jī)體MMP-9濃度增加后，生理反應(yīng)性導(dǎo)致TIMP-1濃度相對增加，并不能反映NSCLC疾病進(jìn)展和階段狀態(tài)[15]；② TIMP-1濃度增加可能也受到肺部其他疾病影響, 如報(bào)道肺纖維化患者和肺癌患者血清TIMP-1即無差異[14]，提示TIMP-1并非是參與NSCLC發(fā)病機(jī)制的特異性指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)血清MMP-9和TIMP-1濃度均可有效區(qū)分健康人群和NSCLC患者：血清MMP-9診斷NSCLC的AUC為0.843，敏感度和特異度分別為65.7%和88.0%，血清TIMP-1診斷NSCLC的AUC 為0.654，敏感度和特異度分別為59.4%和71.0%。CEA 是一種具有人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白, 編碼基因位于19 號染色體, 是肺癌診斷中廣泛應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物，對肺腺癌的檢出靈敏度較高[16]。本研究將MMP-9和TIMP-1診斷新發(fā)NSCLC效能與CEA比較，傳統(tǒng)NSCLC腫瘤標(biāo)志物CEA診斷NSCLC 的AUC 為0.775，敏感度和特異度為54.7%和87.0%，血清MMP-9在檢測NSCLC上優(yōu)于CEA，而TIMP-1診斷效能低于CEA。

NSCLC患者血清MMP-9及TIMP-1濃度對NSCLC診斷效能的文獻(xiàn)較少。Bigbee[14]等人提出一種血清多蛋白標(biāo)志組，用于補(bǔ)充區(qū)分NSCLC患者與無癌對照患者，在全部70種肺癌相關(guān)蛋白中，發(fā)現(xiàn)MMP-1和-9均能夠區(qū)分對照組健康人群、肺纖維化人群和NSCLC人群，具有輔助診斷意義。Fiorelli[17]等人將MMP-9與正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography PET)結(jié)合使用來診斷肺部疑難病變的良惡性，發(fā)現(xiàn)PET和MMP-9結(jié)合確診惡性病變的敏感度為94%，特異度為100%。結(jié)合本研究結(jié)果，表明血清MMP-9 具有潛在輔助診斷NSCLC患者能力，需要與其他標(biāo)志物和診斷手段結(jié)合，可提高診斷效能。

當(dāng)然，本研究也存在一定的不足，比如，是否可以用T分期對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行分類，并比較濃度差異，值得進(jìn)一步研究。

綜上，NSCLC患者血清MMP-9和TIMP-1濃度增高，MMP-9診斷NSCLC效能優(yōu)于CEA,是潛在NSCLC診斷分子標(biāo)志物, 具有輔助診斷價值，值得更大規(guī)模的前瞻性研究驗(yàn)證本結(jié)果。