林慧文 吳 哲 梁 瑩 蔡中瓊 梁志健 鐘志勇

1 廣州市第十二人民醫(yī)院(廣州 510620) 2 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(佛山 528248)

雷公藤制劑是臨床上常用的免疫制劑，在臨床上主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、慢性腎病、各種類型的銀屑病等，在婦科疾病尤其是子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等取得良好的效果，但對人體消化、血液、生殖、內(nèi)分泌等系統(tǒng)均有損傷，特別是生殖毒性[1- 2]中的卵巢功能損害，表現(xiàn)為女性月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)、性欲低下、卵巢早衰等。雷公藤多苷片是最早研制成功的、迄今應(yīng)用最廣泛的雷公藤制劑[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討雷公藤多苷片建立卵巢早衰小鼠模型的可行性，研究卵巢早衰模型小鼠的自身修復(fù)性變化，為深入研究POF 的病理生理機(jī)制和預(yù)防措施，探索安全有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤多苷片，批號：20151002，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司產(chǎn)品；氯化鈉注射液，批號：A16092708，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；小鼠E2試劑盒、批號：20161229，小鼠LH試劑盒、批號：20161227，小鼠FSH試劑盒、批號：20161227，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。SPF級BALB/c小鼠，40只，雌性，7～8周齡，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，質(zhì)量合格證號：44007200033964，動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房，群養(yǎng)，5只/籠，采用12 h：12 h晝夜間斷照明；自由進(jìn)食飲水，動物實(shí)驗(yàn)證明號：00157546。本實(shí)驗(yàn)涉及的與動物試驗(yàn)相關(guān)的內(nèi)容和程序經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會審核，遵從實(shí)驗(yàn)動物使用和管理的相關(guān)法律法規(guī)，保證實(shí)驗(yàn)動物的福利，倫理審查編號為B201609-19。

1.2 儀器設(shè)備

顯微圖像軟件，型號：CellSens Dimension；熒光顯微鏡、型號：BX41，生物顯微鏡，型號：CX21和BX43，均日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；電子天平，型號：JEA3001，上海浦春計(jì)器有限公司產(chǎn)品；生物組織包埋機(jī)、型號：EG1150，輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、型號：RM2235，全自動脫水機(jī)、型號：ASP300S，全自動染色機(jī)、型號：Auto Stainer-XL，攤片機(jī)和烘片機(jī)、型號：HI1220，均為德國萊卡公司產(chǎn)品；全波長酶標(biāo)儀，型號：Multiskan GO，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 方法[4- 5]

SPF級Balb/c小鼠，飼養(yǎng)至12周齡后，對動物進(jìn)行陰道涂片觀察，連續(xù)7天，鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞分類，以判定動物的動情周期。選36只具有正常動情周期的動物，隨機(jī)分為陰性對照組18只、模型組18只。模型組小鼠按50 mg/kg灌胃給予的雷公藤多苷片溶液，1次/天，連續(xù)14 d，陰性對照組動物同法灌胃給予等量純凈水。每天觀察動物1次，造模期間每周測量1次，每天進(jìn)行陰道涂片，觀察動物的性周期。于造模14 d，停止造模28 d和35 d，每組取6只動物進(jìn)行眼眶取血，稍靜置，2 500 rpm離心15min，取上層血清，檢測FSH、LH、E2含量。采血后頸椎脫臼處死，取雙側(cè)卵巢，測量臟器系數(shù)，中性甲醛固定，HE染色，做組織形態(tài)學(xué)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床觀察和體質(zhì)量結(jié)果(見表1)

實(shí)驗(yàn)期間，陰性對照組小鼠行為表現(xiàn)良好，毛發(fā)潤澤、精神良好，行為活躍。模型組小鼠造模期間均表現(xiàn)為行動遲緩、精神萎靡，脫毛嚴(yán)重，飲食欠佳，倦怠等，且體質(zhì)量有所減輕，模型小鼠在造模14 d的體質(zhì)量與陰性對照組比較降低(P<0.05)。停止造模后，模型對照組小鼠行為，毛發(fā)、精神等方面都逐步恢復(fù)正常，模型組小鼠的體質(zhì)量在各測定時間點(diǎn)與陰性對照組比較均無差異(P>0.05)。

表1雷公藤誘導(dǎo)卵巢早衰模型小鼠體質(zhì)量的動態(tài)變化

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 雷公藤誘導(dǎo)卵巢造模模型小鼠動情周期的變化

陰性對照組小鼠在整個實(shí)驗(yàn)過程中，動情周期規(guī)律，紊亂率均為 0。模型組小鼠在造模前動情周期規(guī)律，紊亂率為0；造模1～14 d，模型組小鼠均出現(xiàn)動情周期延長，8～10 d/次，多處于動情間期，甚至無正常的動情周期，紊亂率為 100%。停止造模1～14 d，模型組小鼠動情周期規(guī)律逐步恢復(fù)，多處于動情前期和動情期，紊亂率為 100%。停止造模15～35 d，模型組小鼠動情周期規(guī)律逐步恢復(fù)正常，紊亂率為0。

2.3 雷公藤誘導(dǎo)的卵巢早衰模型小鼠血清中E2、FSH和LH水平動態(tài)變化(見表2)

表2雷公藤誘導(dǎo)的卵巢早衰模型小鼠血清E2、FSH和LH水平的動態(tài)變化

與陰性對照組比較，“*”P<0.05或“**”P<0.01。

與陰性對照組比較，模型對照組小鼠造模14 d、停止造模27 d、停止造模35 d的E2水平降低(P<0.01)；模型對照組小鼠造模14 d、停止造模27 d、停止造模35 d的FSH水平升高(P<0.01)；模型對照組小鼠造模14 d、停止造模 27 d、停止造模35 d的LH水平升高(P<0.01或P<0.05)

2.4 卵巢系數(shù)結(jié)果(見表3)

與陰性對照組比較，模型對照組小鼠在造模14 d、停止造模28 d和停止造模35 d的卵巢系數(shù)降低(P<0.01或P<0.05)。

表3雷公藤多苷片誘導(dǎo)卵巢早衰模型小鼠卵巢系數(shù)的動態(tài)變化

2.5 病理觀察結(jié)果(見圖1)

陰性對照組小鼠在各測定時間點(diǎn)的卵巢皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，卵泡生長活躍，可見各級卵泡排列規(guī)律，顆粒細(xì)胞層次多，發(fā)育正常，卵巢內(nèi)可見黃體發(fā)育良好，黃體細(xì)胞豐富。模型組小鼠在造模14 d，卵巢組織萎縮，體積減少，皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)混亂，各級卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多、卵母細(xì)胞及透明帶形態(tài)異常，呈變性、固縮或消失等退行性變化及空泡樣改變；黃體數(shù)量減少、體積下降，形態(tài)不規(guī)律。停止造模28 d，模型組小鼠卵巢體積較陰性對照組減小，皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)混亂，各級卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，黃體數(shù)量正常、但形態(tài)不規(guī)律。停止造模35 d，模型組小鼠卵巢體積與陰性對照組比較明顯減小，各級卵泡數(shù)量較模型對照組略微增多，但仍可見閉鎖卵泡；黃體數(shù)量較多，但形態(tài)不規(guī)律。

3 討 論

A、B：造模14 d，陰性對照組、模型對照組卵巢病理圖片。C、D：停止造模27 d后，陰性對照組、模型對照組卵巢病理圖片。E、F：停止造模35 d后，陰性對照組、模型對照組卵巢病理圖片。圖1 各組動物卵巢病理圖片(HE染色×100)

卵巢早衰(POF)是女性在40歲以前持續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮，伴有卵泡刺激素(FSH)升高，雌性激素(E2)降低的綜合征[6]。POF的病因復(fù)雜，主要與遺傳因素、自身免疫性因素、醫(yī)源性損傷、感染及環(huán)境的影響等多種因素所致[7]。雷公藤多甙片作為一種細(xì)胞毒性藥物，對機(jī)體內(nèi)迅速增生的細(xì)胞作用明顯，如淋巴細(xì)胞和卵巢的卵泡細(xì)胞，可導(dǎo)致 DNA 堿基錯配，引起 DNA 鏈斷裂，推測對卵巢毒性的主要原因與損傷卵泡細(xì)胞 DNA 有關(guān)，從而引起卵泡分泌的雌激素水平下降，負(fù)反饋引起 FSH升高[8- 9]，屬于醫(yī)源性損傷的一種常見情況。雷公藤制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，其巨大的毒性帶來的損傷不容忽視。如何正確認(rèn)識雷公藤制劑的治療作用和毒性反應(yīng)，提高臨床用藥的安全性，是我們篩選防治措施以及探討疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的首要問題。借助動物模型的研究，可以更準(zhǔn)確地觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有助于更方便，更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。本研究采用雷公藤多苷片誘導(dǎo)卵巢早衰模型小鼠，研究小鼠在停止造模后體內(nèi)激素以及卵巢的自身修復(fù)性變化，為深入研究POF 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和預(yù)防措施，探索安全有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

FSH和LH為促性腺激素，由垂體前葉分泌，二者協(xié)同作用，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)體內(nèi)E2的分泌[10]。FSH、LH水平是一種能夠反映卵巢儲備能力的指標(biāo)，卵巢儲備力降低能夠?qū)е翭SH、LH水平升高。E2是由竇狀卵泡所產(chǎn)生的，在FSH作用下，隨著卵泡儲存量的降低，E2水平也隨之降低，進(jìn)一步導(dǎo)致了FSH的升高，因此FSH、LH、E2的水平高低可作為監(jiān)測卵巢儲備能力的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，模型對照組小鼠的FSH、LH升高，E2下降，均有差異(P<0.05或0.01)，說明雷公藤制劑成功誘導(dǎo)出卵巢早衰模型小鼠，而且停止造模35 d后，模型小鼠的血液指標(biāo)尚未恢復(fù)正常。造模14 d，模型對照組動物卵巢萎縮、結(jié)構(gòu)混亂，各級卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡增多，黃體數(shù)量減少、體積下降、形態(tài)不規(guī)律等病理變化。停止造模28 d和35 d，模型組小鼠的卵巢組織均較陽性對照組小，皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)混亂，各級卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡增多，黃體數(shù)量正常、但形態(tài)不規(guī)律。

本研究結(jié)果顯示，雷公藤多苷片可誘導(dǎo)的卵巢早衰模型小鼠，其作用機(jī)制可能與損傷卵巢細(xì)胞結(jié)構(gòu)所引起卵巢萎縮有密切關(guān)系，動物卵巢受損害的病理結(jié)果與人類有一致之處(卵巢萎縮，各級卵泡減少，間質(zhì)增加，淋巴細(xì)胞浸潤等)。該模型在激素水平以及卵巢病理的自身修復(fù)需要較長的時間。