汪 菁，徐晶晶，陳 玲，劉 文，宋雅嫻，胡 月，彭亞琴，吳麗敏，公顏平，于 婷

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，更多基于測(cè)序的分子診斷方法越來越成熟，基于高通量測(cè)序的基因組拷貝數(shù)變異(CNV-Seq)是其中一種新興的應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的檢測(cè)方法，有助于檢測(cè)出染色體的微缺失和微重復(fù)，提高染色體異常檢出率?，F(xiàn)對(duì)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的高齡孕婦羊水樣本同時(shí)進(jìn)行染色體G帶核型分析和CNV-Seq檢測(cè)，對(duì)該檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，旨在探討CNV-Seq是否能夠有效提高高齡孕婦染色體異常檢出率，從而達(dá)到降低高齡妊娠出生缺陷率的目的。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018年1～8月在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷的80例孕周為18周+3～28周、年齡為35～45歲的高齡孕婦，通過羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水樣本80份，同時(shí)進(jìn)行染色體G顯帶核型分析和CNV-Seq檢測(cè)，孕婦簽署產(chǎn)前診斷和CNV-Seq知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 孕婦在B超引導(dǎo)下，由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)師行羊膜腔穿刺術(shù)，每個(gè)孕婦抽取3管羊水，每管10 ml，共30 ml羊水，其中2管羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，供染色體核型分析，剩余1管進(jìn)行CNV-Seq檢測(cè)。

1.2.2染色體G顯帶核型分析 抽取20 ml羊水進(jìn)行細(xì)胞接種，每個(gè)孕婦的樣本進(jìn)行兩線培養(yǎng)，培養(yǎng)至7 d左右顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液培養(yǎng)，1～2 d后進(jìn)行細(xì)胞收獲、染色制片、核型分析。

1.2.3CNV-Seq檢測(cè) 抽取10 ml羊水，樣本由華大基因公司完成CNV-Seq，該檢測(cè)針對(duì)染色體非整倍體變異和100 kb以上的CNV，其方法如下：使用DNAeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)從羊水細(xì)胞中分離基因組DNA，使用50 ng基因組DNA作為起始模板，構(gòu)建測(cè)序文庫，最后在BGISEQ-500測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。使用Burrows-Wheeler Aligner(Version0.7.7)比對(duì)軟件將讀序信息與人類參考基因組(GRCh37,UCSC release hg19)進(jìn)行比對(duì)、分析得到生物信息學(xué)結(jié)果，判斷是否存在染色體非整倍體變異和CNV，并通過ISCA、Decipher、Clinvar等數(shù)據(jù)庫查詢，對(duì)檢測(cè)到的CNV的致病性進(jìn)行評(píng)估。

1.3 隨訪對(duì)所有孕婦進(jìn)行電話隨訪，追蹤妊娠結(jié)局及新生兒健康狀況。

2 結(jié)果

2.1 染色體G顯帶核型分析結(jié)果本研究對(duì)80例高齡孕婦同時(shí)進(jìn)行了羊水細(xì)胞染色體核型分析和羊水CNV-Seq檢測(cè)，染色體核型分析檢測(cè)出13例異常核型，其中21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，低比例嵌合2例(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，染色體異常檢出率為16.25%，致病性異常檢出率為13.75%。見表1。

2.2 CNV-Seq檢測(cè)結(jié)果CNV-Seq檢測(cè)結(jié)果致病性染色體異常例數(shù)14例，異常檢出率17.5%，其中21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，明確致病性染色體微缺失2例，可能致病性染色體微缺失1例，臨床意義未明的染色體微缺失、微重復(fù) 39例，致病性染色體異常檢出率為17.5%，在染色體G顯帶核型分析結(jié)果基礎(chǔ)上致病性染色體異常檢出率增加了3.75%。

2.3 染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測(cè)結(jié)果染色體G顯帶核型分析聯(lián)合CNV-Seq檢測(cè)的致病性異常例數(shù)為14例，致病性異常檢出率為17.5%，比單一的染色體G顯帶核型分析高出3.75%。染色體G顯帶核型分析比CNV-Seq檢測(cè)額外檢出了2例小于10%的低比例嵌合(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，CNV-Seq檢測(cè)比染色體G顯帶核型分析額外檢出了2例明確致病性染色體微缺失和1例可能致病性染色體微缺失(表2)，兩種方法對(duì)于其他染色體非整倍體異常的檢出結(jié)果一致。

表1 染色體核型異常結(jié)果及其相應(yīng)CNV-Seq結(jié)果

*為染色體核型低比例嵌合病例

表2 致病性染色體微缺失結(jié)果

2.4 隨訪結(jié)果對(duì)所有高齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)后電話隨訪，11例致病性染色體異常患者已進(jìn)行引產(chǎn)；2例染色體非整倍體異常孕婦已足月分娩，其中1例為47,XXX，足月分娩，尚未見明顯異常，1例為47,XN,+21，足月分娩(孕婦強(qiáng)烈要求保留胎兒)，胎兒出生后已出現(xiàn)心臟異常；1例疑似致病染色體16p11.1p11.2微缺失，已足月分娩，未見明顯異常；2例低比例嵌合，足月分娩，未見明顯異常。

3 討論

CNV-Seq是一項(xiàng)基于高通量測(cè)序技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)，可通過測(cè)序深度的調(diào)整，改變分辨率，檢測(cè)不同大小的CNV，本研究中所用的方法分辨率為100 kb，該方法可很好的彌補(bǔ)核型分析分辨率低的不足。CNV-Seq的優(yōu)勢(shì)主要有檢測(cè)范圍廣、高通量、周期短、分辨率高、操作簡(jiǎn)便、低DNA樣本量[1]，并且已有很多研究者對(duì)該方法的適用性進(jìn)行評(píng)估，Wang et al[2]報(bào)道該技術(shù)相較于核型分析對(duì)致病性或可能致病性的檢出率由1.8%提高至2.8%，有很好的可靠性和準(zhǔn)確性。本研究對(duì)80例高齡孕婦的羊水樣本同時(shí)進(jìn)行了CNV-Seq和核型分析，致病性異常14例，檢出率為17.5%，致病性染色體非整倍體異常11例，包括21三體6例，18三體3例，性染色體非整倍體異常2例，致病性染色體微缺失3例(明確致病的染色體微缺失2例，可能致病的染色體微缺失1例)。CNV-Seq和核型分析均檢測(cè)出致病性染色體非整倍體異常，但3例致病性染色體微缺失，均未在核型分析時(shí)被檢測(cè)到。該結(jié)果表明對(duì)高齡孕婦實(shí)施產(chǎn)前診斷非常必要，并且應(yīng)用CNV-Seq能明顯增加致病性染色體微缺失、微重復(fù)的檢出率。染色體微缺失、微重復(fù)會(huì)導(dǎo)致一些復(fù)雜臨床表型(如生長(zhǎng)發(fā)育異常、智力發(fā)育遲緩、內(nèi)臟器官畸形、內(nèi)分泌異常等)的綜合征發(fā)生，是染色體疾病中的常見類型，目前已發(fā)現(xiàn)67余種染色體微缺失、微重復(fù)綜合征，發(fā)病率約在1/4 000～1/50 000[3]。通過本研究證實(shí)CNV-Seq是檢測(cè)該種染色體畸變的有效方法，因此對(duì)高齡孕婦的產(chǎn)前診斷聯(lián)合應(yīng)用核型分析和CNV-Seq有很重要的臨床意義。

對(duì)3例核型分析未檢測(cè)到的致病性染色體微缺失結(jié)果分析如下：① 致病性染色體微缺失病例1：Y染色體長(zhǎng)臂部分(24,026,787～26,227,153)片段缺失一個(gè)拷貝，長(zhǎng)約2.20 Mb，為已知致病突變。該區(qū)域包含于“Spermatogenic failure, Y-linked”報(bào)道區(qū)域內(nèi)，并且覆蓋該病相關(guān)的“AZFc region”的主要基因BPY2、DAZ、CDY1等，Y染色體AZFc區(qū)域缺失是導(dǎo)致男性生精障礙最常見的原因。"Spermatogenic failure, Y-linked”的主要臨床特征為無精癥、輕度至嚴(yán)重少精癥，從而導(dǎo)致男性不育。個(gè)體間臨床表征具有差異性。阿周存 等[4]2006年報(bào)道，對(duì)128例嚴(yán)重寡精癥患者和287個(gè)正常生精男性的DAZ基因缺失進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DAZ1/DAZ2/DAZ3/DAZ4缺失僅見于嚴(yán)重寡精癥患者，頻率為11.7%；DAZ1/DAZ2缺失的頻率在嚴(yán)重寡精癥患者中顯著高于正常男性(9.4%vs2.8%,P=0.004)；這些結(jié)果提示DAZ基因全部拷貝缺失是嚴(yán)重寡精癥患者生精障礙的常見遺傳病因，而DAZ1/DAZ2缺失則可能是一種高風(fēng)險(xiǎn)因素。該孕婦已進(jìn)行引產(chǎn)。② 致病性染色體微缺失病例2：X染色體短臂部分(6,427,993～8,147,809)片段缺失一個(gè)拷貝，長(zhǎng)約1.72 Mb，為已知致病變異。該區(qū)域包含OMIM收錄的致病基因STS，STS基因功能異常關(guān)聯(lián)疾病“Ichthyosis, X-linked”。多篇文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道，在X-linked ichthyosis患者中檢出STS基因部分或全基因缺失突變?！癐chthyosis, X-linked”的臨床表現(xiàn)包括：眼角膜混濁，視力通常不受影響；魚鱗病，皮損通常對(duì)稱發(fā)生，主要發(fā)生在四肢、頭皮、頸部和軀干上，呈棕色；男性隱睪，睪丸癌風(fēng)險(xiǎn)增加；產(chǎn)前表現(xiàn)為晚產(chǎn)；出生后1年內(nèi)發(fā)病，大部分(80%～90%)由STS基因缺失導(dǎo)致，男性發(fā)病率為1 ∶6 000[8-9]。該病呈X連鎖隱性遺傳，本送檢樣本檢出STS基因缺失一個(gè)拷貝，由于該孕婦胎兒為男性，則會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。該孕婦已進(jìn)行引產(chǎn)。③ 可能致病性染色體微缺失病例3：16號(hào)染色體短臂部分(34,214,421～35,180,066)片段缺失一個(gè)拷貝，長(zhǎng)約965.64 kb，為疑似致病變異。據(jù)Molck et al[10]報(bào)道，在1例表型為動(dòng)脈閉鎖、室間隔缺損和肺動(dòng)脈閉鎖缺陷的患者中檢出了16p11.1p11.2區(qū)域的缺失變異，長(zhǎng)約961 kb，該區(qū)域包含基因UBE2MP1、LOC146481、LOC100130700、RN5S411和FLJ26245。本次檢出變異與文獻(xiàn)報(bào)道變異相近，為疑似致病變異。電話隨訪，該孕婦足月分娩，目前未發(fā)現(xiàn)明顯異常，將繼續(xù)對(duì)其隨訪了解其遠(yuǎn)期預(yù)后。

本研究中有2例核型分析檢出的10%以下低比例嵌合異常未能通過CNV-Seq檢測(cè)到，此案例一方面反映了CNV-Seq的不足，但另一方面也能在未實(shí)施其他方法復(fù)查的情況下通過CNV-Seq印證該羊水細(xì)胞嵌合比例低于10%。臨床建議這2例孕婦去其他醫(yī)院通過FISH復(fù)查，但孕婦拒絕。羊水培養(yǎng)中很容易出現(xiàn)假性嵌合，羊水中假性嵌合體大多為兩條染色體的易位、一條染色體的丟失、標(biāo)記染色體、一條染色體的增加和染色體部分三體等，大部分妊娠結(jié)局良好[11]。該兩例嵌合，1例為46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]，另1例為47,XN,+2[10]/46,XN[120]，嵌合比例較低，并且比較符合羊水假性嵌合體，在孕婦未通過其他方法驗(yàn)證的情況下，B超監(jiān)測(cè)并隨訪，該2例孕婦均已足月分娩，未發(fā)現(xiàn)異常。

通過此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高齡與染色體異常密切相關(guān)，并且該染色體異常不僅包括非整倍體染色體異常，也包括染色體的微缺失和微重復(fù)。因此在對(duì)高齡孕婦實(shí)施產(chǎn)前診斷時(shí)，聯(lián)合核型分析和CNV-Seq檢測(cè)將有效提高致病性檢出率，降低出生缺陷，為臨床的產(chǎn)前咨詢提供有效可靠的依據(jù)。