高彩虹，戴媛媛，常文嬌，馬筱玲

金黃色葡萄球菌(以下簡(jiǎn)稱金葡菌)是臨床常見(jiàn)的病原菌，能引起從皮膚軟組織感染到菌血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、深部膿腫等多種感染性疾病[1]。該菌易獲得耐藥性，從臨床標(biāo)本中分離的金葡菌約50%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2]。萬(wàn)古霉素是治療嚴(yán)重MRSA感染的首選藥物[3]，但隨著臨床用量增加，低水平萬(wàn)古霉素耐藥金葡菌開(kāi)始出現(xiàn)，包括萬(wàn)古霉素中介金葡菌(vancomycin intermediateStaphylococcusaureus，VISA)和異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金葡菌(heterogeneous vancomycin intermediateStaphylococcusaureus，h-VISA)。研究[4]顯示，hVISA/VISA感染的臨床特點(diǎn)為細(xì)菌難以清除，感染癥狀持續(xù)存在，反復(fù)發(fā)作，給治療帶來(lái)極大困難。

VraSR(Vancomycin resistance-associated sensor regulator)是金葡菌萬(wàn)古霉素耐藥相關(guān)感應(yīng)二元調(diào)控子。研究[5]顯示，VraSR的表達(dá)水平在hVISA/VISA中明顯上升。附屬基因調(diào)節(jié)因子(accessory gene regulator，agr)是金葡菌最重要的全局調(diào)控子，對(duì)毒力和生物膜均具有調(diào)控作用[6]，前期研究[7]結(jié)果顯示VraR蛋白可直接與agr啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，提示VraSR可能具有廣泛的調(diào)控作用。由此，該研究通過(guò)構(gòu)建萬(wàn)古霉素異質(zhì)性耐藥標(biāo)準(zhǔn)菌(Mu3)vraSR基因敲除株、回補(bǔ)株以及小鼠皮膚感染模型，探討VraSR表達(dá)在金葡菌致病中發(fā)揮的作用，以期為基于VraSR為靶點(diǎn)的hVISA/VISA感染診斷和干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和動(dòng)物 異質(zhì)性萬(wàn)古霉素中介金葡菌(Mu3)和質(zhì)粒pLI50由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院李家斌教授饋贈(zèng)；金葡菌RN4220為限制性內(nèi)切酶缺陷菌株；溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKOR1和大腸桿菌DC10B由皖南醫(yī)學(xué)院朱濤博士饋贈(zèng)。昆明小鼠(Kunming mice,KM小鼠)購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，6～8周齡。

1.1.2主要試劑及儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；氯霉素、脫水四環(huán)素、溶葡萄球菌素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；萬(wàn)古霉素藥物敏感性試紙條購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth,TSB)、LB培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司；Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；ABI7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中金葡菌Mu3基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)vraSR基因上游片段引物(vraSR-UF、vraSR-UR)、下游片段引物(vraSR-DF、vraSR-DR), 所設(shè)計(jì)的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

下劃線分別代表attB1和attB2特異性位點(diǎn)；vraSR-UR和vraSR-DF中小寫(xiě)字母為上下游同源片段之間的互補(bǔ)序列；方框部分為限制性酶切位點(diǎn)

1.2.2金黃色葡萄球菌vraSR基因敲除株的構(gòu)建 以金黃色葡萄球菌Mu3基因組DNA為模板，以引物vraSR-UF、vraSR-UR和引物vraSR-DF、vraSR-DR分別擴(kuò)增上下游同源片段，具體引物序列見(jiàn)表1。使用融合PCR得到上下游序列相連的DNA序列。使用Gateway BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(日本TaKaRa公司)試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒的重組反應(yīng)，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。通過(guò)PCR及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR是否正確。從大腸桿菌DC10B中抽提的重組質(zhì)粒pKOR1-vraSR首先電轉(zhuǎn)入(電轉(zhuǎn)條件：電壓2.5 kV,電容25 μF,電阻100 Ω)金黃色葡萄球菌RN4220中，從金黃葡萄球菌RN4220抽提的重組質(zhì)粒以相同條件電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌Mu3后，在42 ℃含10 μg/ml氯霉素的TSB培養(yǎng)基中多次傳代(4～5 次)，將菌液104倍稀釋鋪板到含1 μg/ml脫水四環(huán)素(ATc)的TSB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取50個(gè)菌落分別接種普通TSB平板和含10 μg/ml氯霉素的TSB平板，培養(yǎng)過(guò)夜。選擇僅在TSB平板上生長(zhǎng)的克隆抽提基因組DNA，使用引物vraSR-IF和vraSR-IR進(jìn)行PCR擴(kuò)增初步鑒定vraSR基因是否從基因上敲除成功，最后通過(guò)序列測(cè)定RT-PCR證明敲除株構(gòu)建成功,敲除株命名為ΔvraSR。

1.2.3金黃色葡萄球菌CΔvraSR基因回補(bǔ)株的構(gòu)建 首先構(gòu)建金黃葡萄球菌vraSR基因表達(dá)質(zhì)粒,使用表1中引物vraSR-C-F和vraSR-C-R擴(kuò)增vraSR基因，使用sac I和Kpn I將vraSR基因克隆到穿梭質(zhì)粒pLI50，獲得重組質(zhì)粒pLI50-vraSR。從大腸桿菌E.coliDH5α中抽提的重組質(zhì)粒首先電轉(zhuǎn)入金黃葡萄球菌RN4220中，從金黃葡萄球菌RN4220抽提的重組質(zhì)粒再電轉(zhuǎn)入ΔvraSR。電轉(zhuǎn)條件同vraSR基因敲除株的構(gòu)建，通過(guò)序列測(cè)定及RT-PCR證明回補(bǔ)成功。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金葡菌Mu3、ΔvraSR和CΔvraSR。利用TRIzol試劑提取總RNA,按試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。使用的引物序列如下：vraSR-1(F):5′-TGTTGCTCTCAAAAACTGTTCAATA-3′,vraSR-1(R):5′-CCTATTCATATTGGTT-TCGGAA-3′；16sRNA-1(F):5′-CGTGCTACAATGGACAATACAAA-3′，16sRNA-2(R):5′-ATCTACGATTACTAGCGATTCCA-3′。以16sRNA mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參,檢測(cè)各菌株中vraSR基因的表達(dá)水平。

1.2.5小鼠皮膚膿腫模型的建立 參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法，將金葡菌Mu3、ΔvraSR和CΔvraSR在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，收集細(xì)菌后用無(wú)菌PBS調(diào)節(jié)菌濃度至1×109CFU/ml,取50 μl金黃色葡萄球菌在小鼠背部進(jìn)行皮下注射，每一菌株接種5只小鼠，對(duì)照組接種50 μl PBS。1周后將小鼠用4%水合氯醛麻醉后解剖觀察并測(cè)量小鼠皮膚膿腫面積。

1.2.6平板法統(tǒng)計(jì)皮膚組織中的荷菌數(shù) 將皮膚組織充分研磨后的組織懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布于血瓊脂平板上，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算皮膚組織中的荷菌數(shù)。

1.2.7石蠟切片的制備 使用皮膚采樣器無(wú)菌采集感染后的皮膚組織，置于多聚甲醛固定過(guò)夜后，按照常規(guī)組織切片的方法制備石蠟切片,并進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 Mu3中vraSR基因敲除株ΔvraSR和基因互補(bǔ)株CΔvraSR的構(gòu)建Mu3與vraSR基因敲除株ΔvraSR基因組DNA以vraSR-IF和vraSR-IR為引物的PCR結(jié)果見(jiàn)圖1A，以Mu3為模板，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 755 bp，以vraSR基因敲除株DNA為模板，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp。對(duì)vraSR基因敲除株進(jìn)行回補(bǔ)后，Mu3與vraSR基因回補(bǔ)株CΔvraSR基因組DNA以vraSR-C-F和vraSR-C-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1B)， PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度均為1 662 bp。通過(guò)熒光定量分析Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR菌株中vraSR基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了確認(rèn)，在vraSR基因缺失株中vraSR基因的轉(zhuǎn)錄完全缺失，對(duì)vraSR缺失株的質(zhì)?；匮a(bǔ)回復(fù)了vraSR基因的轉(zhuǎn)錄(t=17.7，P<0.001)(圖1C)。以上結(jié)果均證明vraSR基因被敲除及回補(bǔ)成功。

圖1 構(gòu)建金黃色葡萄球菌vraSR基因敲除株及回補(bǔ)株

A：用PCR方法篩選vraSR基因敲除株；B：用PCR方法篩選vraSR基因回補(bǔ)株；M：2 000 bp DNA Marker；WT：野生株Mu3；2和3：CΔvraSR菌株；C：RT-PCR檢測(cè)Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR菌株中vraSR基因的mRNA表達(dá)水平；與ΔvraSR比較：***P<0.001

2.2 敲除vraSR基因降低金葡菌的致病性與Mu3菌株比較，ΔvraSR菌株接種小鼠后肉眼觀察皮膚病變較輕，Mu3和ΔvraSR菌株的膿腫面積分別為(1.58±0.31)cm2、(0.71±0.15)cm2(t=5.634，P<0.001)。CΔvraSR株形成膿腫面積為(1.15±0.30)cm2(t=2.864,P<0.05)，表明回補(bǔ)vraSR基因后增加金葡菌致病性(圖2A、2B)。另外，通過(guò)分析小鼠皮膚組織的菌負(fù)荷量顯示，ΔvraSR株接種小鼠皮膚組織菌負(fù)荷量也顯著減少(t=3.356,P<0.01)?；匮a(bǔ)vraSR基因后小鼠皮膚組織菌負(fù)荷量增加(t=2.521,P<0.05)(圖2C)。取小鼠皮膚組織進(jìn)行HE染色觀察顯示Mu3感染組小鼠皮膚組織病理?yè)p傷明顯加重，主要表現(xiàn)為顯著的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而ΔvraSR感染組小鼠皮膚組織病理?yè)p傷較輕，未發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。以上結(jié)果表明，Mu3菌株中vraSR基因缺失可以明顯降低金黃色葡萄球菌的致病性。

3 討論

二元調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system，TCRS)是細(xì)菌中常見(jiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，也是基因表達(dá)的重要調(diào)控系統(tǒng)。細(xì)菌可以利用TCRS調(diào)節(jié)毒力、代謝、營(yíng)養(yǎng)等一系列生理過(guò)程，從而協(xié)助其適應(yīng)外界環(huán)境，在細(xì)菌的致病性中發(fā)揮重要作用[9]。VraSR是一種與萬(wàn)古霉素耐藥相關(guān)的二元調(diào)控系統(tǒng)，在VISA/hVISA中高表達(dá)[5]。然而，目前對(duì)VraSR的研究均集中在耐藥調(diào)控方面，其在金葡菌致病性中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本課題組采用pKOR1和 pLI50為載體，分別構(gòu)建金葡菌vraSR基因敲除株及其回補(bǔ)株，并利用RT-PCR驗(yàn)證構(gòu)建成功。pKOR1質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是有用于lambda重組的位點(diǎn)(attP1、attP2)，可快速構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，無(wú)需人為導(dǎo)入抗生素抗性基因，可避免影響其他基因功能。質(zhì)粒pKOR1的另一個(gè)特點(diǎn)是在脫水四環(huán)素誘導(dǎo)條件下可表達(dá)secY的反義RNA,secY是葡萄球菌的必須基因，因此整合了該質(zhì)粒的菌株將無(wú)法存活[10]。由于以上特點(diǎn)，采用質(zhì)粒pKOR1可以極大地提高目的基因的敲除效率。

VraSR是萬(wàn)古霉素耐藥相關(guān)二元調(diào)控系統(tǒng),由組氨酸激酶VraS和反應(yīng)調(diào)控蛋白VraR兩個(gè)部分組成。研究[11]顯示VraSR可感受外界壓力變化,參與細(xì)胞壁調(diào)節(jié)。細(xì)胞壁是包被于細(xì)菌細(xì)胞最外側(cè)具有堅(jiān)韌性和彈性的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。金葡菌細(xì)胞壁的主要成分包括肽聚糖、脂磷壁酸、壁磷壁酸及脂蛋白。這些胞壁成分常在宿主免疫系統(tǒng)針對(duì)金葡菌感染產(chǎn)生多種趨化因子和細(xì)胞因子的過(guò)程中發(fā)揮作用。有研究[12]顯示缺乏壁磷壁酸的菌株對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的吸附性明顯降低，與動(dòng)物心內(nèi)膜炎模型中金葡菌毒力降低有關(guān)。另有報(bào)道稱脂磷壁酸能夠激發(fā)中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[13]，而肽聚糖與脂磷壁酸協(xié)同作用可在體內(nèi)引發(fā)炎癥反應(yīng)[14]。研究[11]顯示vraSR在保持細(xì)胞壁肽聚糖完整性上發(fā)揮重要作用, 缺失vraSR基因的菌株細(xì)胞壁合成能力明顯降低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色檢測(cè)小鼠皮膚組織病理變化，結(jié)果表明，ΔvraSR感染組小鼠皮膚組織炎性浸潤(rùn)顯著降低。

圖2 小鼠皮膚膿腫形成

A：小鼠皮膚感染大體標(biāo)本；B：小鼠膿腫面積大??；C：小鼠皮膚組織菌負(fù)荷量；與ΔvraSR比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；D：各組小鼠皮膚組織HE染色；a：生理鹽水組；b：Mu3菌株組；c：ΔvraSR菌株組；d：CΔvraSR菌株組；1：×2；2：×40

本課題組前期研究[7]表明VraR蛋白可以直接與agr啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。agr是金葡菌中研究最多也最為透徹的二元調(diào)控系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)胞外蛋白毒素及細(xì)胞表面相關(guān)蛋白的表達(dá)[6]。agr調(diào)控可以使金葡菌從感染的定植階段向感染后期入侵、獲取宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)階段過(guò)渡[15]。由此推測(cè)VraSR可能通過(guò)agr間接參與金葡菌毒力調(diào)控。毒力是決定細(xì)菌致病力的關(guān)鍵因素。本研究采用小鼠皮膚膿腫模型證實(shí)敲除vraSR基因后，金葡菌的致病性顯著下降。

綜上所述，敲除金葡菌vraSR基因可以明顯降低金葡菌皮膚膿腫的形成及炎癥反應(yīng)，證實(shí)VraSR在金葡菌的致病性中發(fā)揮重要作用。VraSR通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)金葡菌致病性，其機(jī)制是否與agr調(diào)控系統(tǒng)及細(xì)胞壁合成相關(guān)需進(jìn)一步深入研究。