黃 野，李紅昌，畢禮明，陳亞峰，高 磊，潘麗蕓，孫文杰，劉 歡，李 劼，奉典旭

關(guān)于急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的實(shí)驗(yàn)性研究[1-5]表明AP的發(fā)生發(fā)展與自噬密切相關(guān)。自噬相關(guān)蛋白Beclin1在自噬過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用[6]。AP治療領(lǐng)域的研究顯示，炎癥水平與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-18(interleukin-18,IL-18)等促炎癥細(xì)胞因子是AP從局部免疫反應(yīng)發(fā)展到全身炎癥反應(yīng)綜合征并最終導(dǎo)致死亡的關(guān)鍵因素，IL-18的水平在一定程度上可以代表疾病的炎癥程度[7]。

該研究隨機(jī)收集AP患者，分別為輕型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)以及健康人作為對(duì)照。各組留取血液，檢測(cè)血清淀粉酶((amylase, Amy)、Beclin1及IL-18，同時(shí)進(jìn)行改良CT嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(modified CT severity index，MCTSI)、急性生理與慢性健康評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluation,APACHE-Ⅱ)，探討AP發(fā)病時(shí)血清Beclin1與IL-18水平以及疾病嚴(yán)重程度關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1資料來(lái)源 本研究入組者患者，共30例，其中MAP患者10例，SAP患者10例，正常對(duì)照10例。入組者采集時(shí)間：2013年10月～2015年12月。

1.1.2AP入組標(biāo)準(zhǔn) 參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科分會(huì)胰腺外科學(xué)組《急性胰腺炎診治指南(2014)》。符合以下3項(xiàng)特征中的2項(xiàng)可診斷為AP：腹痛 (急性、突發(fā)、持續(xù)、劇烈的上腹部疼痛，常向背部放射)；血清Amy和(或)脂肪酶活性至少高于正常上限值3 倍；增強(qiáng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)/磁共振成像或腹部超聲呈AP影像學(xué)改變。

本研究入組的AP患者同時(shí)符合以下條件：患者發(fā)病24 h內(nèi)進(jìn)入本研究機(jī)構(gòu)；患者年齡為18～70(43.36±6.32)歲；既往無(wú)嚴(yán)重的心、腦、肺、腎、肝等基礎(chǔ)疾病。① MAP診斷標(biāo)準(zhǔn)符合AP診斷，不伴有器官功能衰竭及局部或全身并發(fā)癥。② SAP診斷標(biāo)準(zhǔn)符合AP診斷，有器官功能衰竭，或存在局部或全身并發(fā)癥。

1.1.3主要的試劑及儀器設(shè)備 Beclin1 ELISA檢測(cè)試劑盒、IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生(USCN)科技股份有限公司；離心機(jī)(Centrifuge 5810)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；超低溫冰箱(MDF-382E) 購(gòu)自日本Sanyo公司；64排螺旋CT購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司；自動(dòng)生化檢測(cè)儀(INTEGRA 400) 購(gòu)自上海Cobas公司。

1.2 研究方法

1.2.1研究分組 在符合入組標(biāo)準(zhǔn)的前提下，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組：① 對(duì)照組(Ctr)：無(wú)任何基礎(chǔ)疾病的健康者。② MAP組：患者符合上述MAP入組標(biāo)準(zhǔn)。③ SAP組：患者符合上述SAP入組標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2標(biāo)本采集 各組留取靜脈血5 ml，AP患者血液系入院后留取，保證在發(fā)病24 h內(nèi)。采集的血液標(biāo)本常溫下靜置2 h，高速離心機(jī)4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝入EP管中，放置入﹣80 ℃冰箱內(nèi)保存。用于檢測(cè)血清Amy、Beclin1及活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

拷貝AP患者入院24 h內(nèi)腹部增強(qiáng)CT圖片，用于進(jìn)行腹部CT評(píng)分。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1Amy測(cè)定 經(jīng)本院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.3.2血清Beclin1測(cè)定 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行。

1.3.3血清ROS含量測(cè)定 ROS的檢測(cè)也是采用ELISA試劑盒，具體操作同血清Beclin1的測(cè)定方法相同。

1.3.4腹部CT評(píng)分 腹部CT評(píng)分采用改良的CT嚴(yán)重指數(shù)評(píng)分(MCTSI)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1。

表1 MCTSI(修正CT嚴(yán)重指數(shù))評(píng)分

MCTSI總分=①+②+③

1.3.5APACHE II評(píng)分 根據(jù)APACHE II評(píng)分表各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。APACHE II評(píng)分表包含年齡指數(shù)、急性生理學(xué)評(píng)分、慢性健康指數(shù)三部分，三部分評(píng)分相加分?jǐn)?shù)，反應(yīng)全身癥狀，分?jǐn)?shù)越高，病情越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度與Ctr組相比，MAP組和SAP組血清Amy、Beclin1、IL-18濃度均升高(P<0.01)；MAP組與SAP組相比，血清Amy、Beclin1、IL-18濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖1。

2.2 腹部CT及MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分正常對(duì)照者CT輪廓光滑，密度均勻，胰腺周邊無(wú)滲出，見(jiàn)圖2A；MAP患者CT提示胰腺體積輕度增大，胰腺周?chē)鹃g隙模糊，見(jiàn)圖2B；SAP患者CT提示胰腺密度降低，結(jié)構(gòu)紊亂，胰腺周?chē)鷿B出液明顯，多累及腹腔和腹膜后間隙，范圍廣泛，見(jiàn)圖2C。

Ctr組MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分基本為零，AP發(fā)病時(shí)MCTSI、APACHE-Ⅱ增高，MAP和SAP與Ctr相比，MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分增高；并且SAP患者M(jìn)CTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分較MAP患者升高。見(jiàn)表3、圖3。

表2 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度

與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖1 血清Amy、Beclin1、IL-18濃度變化與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖2 不同組腹部CT圖像A：Ctr組CT圖像；B：MAP患者CT圖像；C：SAP患者CT圖像表3 各組MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分比較

評(píng)分項(xiàng)目Ctr組MAP組SAP組F值腹部CT評(píng)分0.060±0.0132.409±0.346??6.862±0.877??##279.4APACHE II評(píng)分0.571±0.7874.571±1.134??9.286±1.113??##127.1

與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

圖3 MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分變化與Ctr組比較：**P<0.01；與MAP組比較：##P<0.01

2.3 血清Beclin1與IL-18濃度的相關(guān)性血清Beclin1濃度與血清IL-18濃度做直線(xiàn)相關(guān)回歸分析可得出y=3 821.960 7x+104.304 5，相關(guān)系數(shù)為r=0.918 9，P<0.01，提示血清Beclin1與IL-18濃度相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 血清Beclin1與IL-18相關(guān)性分析

2.4 血清Beclin濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性分析血清Beclin1濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分做直線(xiàn)相關(guān)回歸分析可得出y=10.611 2x-0.596、y=12.980 6x+0.263，相關(guān)系數(shù)為r=0.977 1、r=0.926 0，P<0.01，提示血清Beclin1濃度與MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分相關(guān)。見(jiàn)圖5。

圖5 血清Beclin1與MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分相關(guān)性分析

3 討論

AP臨床上起病急、變化快、并發(fā)癥多，死亡率高，一直是臨床上治療的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)，及時(shí)、準(zhǔn)確、高效地對(duì)AP患者進(jìn)行合理診治尤為重要[8]。明確AP的發(fā)病機(jī)制是提高其治愈率的根本，大多數(shù)研究[9]認(rèn)為其病理基礎(chǔ)系胰蛋白酶原在胰腺細(xì)胞內(nèi)非正常的激活，從而引起胰腺的自我消化，進(jìn)一步引起局部及全身炎癥反應(yīng)。但胰腺細(xì)胞內(nèi)的酶原具體是如何激活的，目前尚不完全清楚，AP時(shí)自噬的改變則是近年新的研究熱點(diǎn)。自噬相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，自噬相關(guān)蛋白Beclin1對(duì)自噬的發(fā)生和發(fā)展有著重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。正常細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，自噬活動(dòng)可通過(guò)吞噬清除炎性小體的免疫學(xué)作用、活性氧以及抑制炎性因子的激活等多個(gè)方面進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生與發(fā)展[12]。然而在AP中，自噬受損，炎癥因子無(wú)法及時(shí)清除，進(jìn)一步引起胰腺細(xì)胞受損[13]。其中，炎癥因子IL-18與AP的病情進(jìn)展密切相關(guān)[7]。

Mareninova et al[4]通過(guò)對(duì)分離胰腺細(xì)胞、動(dòng)物模型和人體組織的研究，發(fā)現(xiàn)AP時(shí)自噬量受損，胰腺腺泡內(nèi)大量異常自噬空泡堆積；自噬的異常增多是導(dǎo)致酶原激活的誘因，他們認(rèn)為自噬的病理性改變導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞空泡的形成以及酶原的激活，最終誘發(fā)了AP 的形成。Beclin1是自噬調(diào)控的重要分子機(jī)制之一，Beclin1的表達(dá)和自噬相互促進(jìn)，血清Beclin1水平的增高可以間接反映AP時(shí)自噬的過(guò)度激活。這也對(duì)臨床治療AP有一定的啟示，或許可以通過(guò)減少自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)而抑制胰腺腺泡細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而減少胰蛋白酶原的激活以及急性胰腺炎時(shí)胰腺組織水腫、出血及壞死的發(fā)生。

本研究顯示，AP患者發(fā)病早期血清自噬相關(guān)蛋白Beclin1水平升高，并且SAP較MAP血清Beclin1水平增高更明顯；Beclin1是自噬形成調(diào)控的主要因子之一，這也提示AP的早期伴隨著自噬的積聚增多。AP發(fā)病時(shí)，IL-18產(chǎn)生增多，并且血清Beclin1與IL-18濃度存在有相關(guān)性。本研究結(jié)果也表明，AP患者M(jìn)CTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分升高較為明顯，并在一定程度上能反映疾病的嚴(yán)重程度；在對(duì)血清Beclin1濃度和MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者有相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：AP患者發(fā)病早期，炎癥水平升高，炎癥因子血清IL-18與血清Beclin1水平正相關(guān)，并且血清Beclin1水平與疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)MCTSI、APACHE-Ⅱ評(píng)分成正相關(guān)，因此對(duì)血清Beclin1水平的檢測(cè)可能是評(píng)估預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度的一個(gè)較為有效的指標(biāo)。在本次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確二者之間具體關(guān)系，可能會(huì)為評(píng)估預(yù)測(cè)AP嚴(yán)重程度，提供更為有力的證據(jù)。