杜雅彥，劉 洋，盧 沐，懷施濤，呂作利，魏育濤

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)是歐洲發(fā)達國家導致死亡的主要因素[1]。隨著經(jīng)濟增長，發(fā)展中國家的心血管疾病數(shù)量也在增加。心外膜脂肪組織(epicardial adipose tissue，EAT)是一種沉積在心肌表面獨特的內(nèi)臟脂肪組織[2]，能分泌脂聯(lián)素(adiponectin，APN，ADIPOQ)等脂肪細胞因子，可能會對心臟功能產(chǎn)生影響，但EAT啟動炎癥發(fā)生的機制并不十分明確。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類大小約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA[3]，通過與靶基因互補位點結(jié)合的方式來調(diào)控基因表達，調(diào)控多種疾病發(fā)生和發(fā)展。miRNAs在CAD發(fā)病機制的各個環(huán)節(jié)中都有作用，但其對CAD發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不明確。該實驗通過芯片篩選結(jié)果顯示，在CAD 患者EAT中，miR-455b-3p高表達。生物信息學預(yù)測，miR-455b-3p與APN靶向結(jié)合。該研究以miR-455b-3p為切入點，探討miR-455b-3p對脂肪細胞分化及脂肪細胞因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年3月～2017年6月在石河子大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心胸外二科行冠狀動脈旁路移植術(shù)的CAD患者34例作為實驗組，對照組為行瓣膜置換術(shù)的非冠心病(non-CAD)患者16例。手術(shù)前收集所有研究對象的一般資料和化驗檢查資料。實驗組符合CAD的診斷標準及納入標準。對照組冠狀動脈造影陰性，需行瓣膜置換手術(shù)(瓣膜為退行性變)且符合納入標準。本研究通過新疆石河子大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(編號：2014-072-01)，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑3T3-L1前體脂肪細胞(中科院上海細胞庫)；引物及內(nèi)參(上海生工公司)；miRNA模擬物及抑制物(上海吉瑪制藥公司)；RNA提取試劑和 qRT-PCR反應(yīng)試劑盒(日本TaKaRa公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；TRIzol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；miRNeasy miRNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)；Thermo Scientific miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1診斷標準 參照我國衛(wèi)生部發(fā)布的《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的診斷標準》(2010年版)以及2011年美國心臟聯(lián)合會(American Heart Association，AHA)冠心病診療指南。

1.3.2納入標準 實驗組：① 年齡40～75(63.8±4.2)歲；② 符合CAD的診斷標準需行冠狀動脈旁路移植術(shù)患者；③ 民族為漢族。對照組：① 年齡40～75(66.5±7.3)歲；② 冠狀動脈造影陰性且需行瓣膜置換手術(shù)(瓣膜為退行性變)患者；③ 民族為漢族。

1.3.3排除標準 ① 合并有糖尿病或糖耐量異常者；② 其他類型心臟病，如風濕性心臟病患者；③ 患有惡性腫瘤者；④ 近期有創(chuàng)傷、外科手術(shù)者；⑤ 急、慢性感染者；⑥ 長期肝、腎等臟器疾病及其他內(nèi)分泌疾病。

1.3.4收集臨床資料 包括患者年齡、性別、身高、體質(zhì)量、病程、大生化、心肌酶、超敏C反應(yīng)蛋白、心臟彩超及頸動脈彩超等。

1.3.5標本采集 留取手術(shù)當天空腹臥位肘靜脈血5 ml，留取血清-80 ℃冰箱保存。開胸后獲取右室表面EAT約1 g，0.9%氯化鈉溶液清洗并去除結(jié)締組織后置于液氮中保存。在所有收集實驗組及對照組標本中各挑選5例患者的EAT用于miRNA芯片檢測，由上海伯豪生物芯片技術(shù)有限公司技術(shù)人員完成Agilent miRNA芯片檢測。[Agilent human miRNA(8*60 K)V18.0 Design ID：70156]同步取患者循環(huán)血約5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿至無酶EP管中，并置于-80 ℃冰箱中暫時凍存。

1.3.6EAT標本基因芯片檢測 ① RNA抽提和純化：采用mirVanaTMPARISTM標準操作流程進行樣品總RNA抽提，抽提所得total RNA經(jīng)電泳質(zhì)檢合格后備用；② RNA的標記：標本RNA按照 miRNA Complete Labeling and Hyb Kit標準操作流程對miRNA分子進行熒光標記；③ 芯片雜交：按照miRNA Complete Labeling and Hyb Kit進行標本雜交實驗。在滾動雜交爐中，55 ℃，20 r/min，滾動雜交20 h之后在洗缸中洗片；④ 芯片掃描：芯片結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，軟件設(shè)置Scan resolution=5 μm，PMT 100%，5%最后采用 Gene Spring Software 11.0 進行歸一化處理，所用的算法為Quantile；⑤ 差異表達：CAD組和non-CAD組間差異表達的miRNAs采用SAS 系統(tǒng)進行篩選[設(shè)定篩選閾值P<0.05，差異倍數(shù)值(fold change)>2且Flag值/Call值為至少一組內(nèi)不出現(xiàn)A(Absent:表示差異無統(tǒng)計學意義) ]。

1.3.7細胞培養(yǎng)與誘導分化 在6孔板中將3T3-L1前脂肪細胞接種于含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%并接觸抑制2 d退出對數(shù)增長期后，更換為終濃度為0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、5 μg/ml胰島素(INS)和1 μmol/L地塞米松(DEX)的細胞分化誘導液誘導2 d后，再更換含有55 μg/ml INS的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隔2 d更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。分化 8 d 后使用油紅O染色鑒定誘導效率。

1.3.8細胞的轉(zhuǎn)染 誘導成功的細胞待細胞密度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。用Opti-MEM稀釋模擬物、抑制劑以及陰性對照組，并分別與轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectmine 2000按2 ∶1混合均勻，室溫放置20 min，使其形成穩(wěn)定的復(fù)合物。再將復(fù)合物加入6孔板中，混勻，將6孔板置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收取細胞，空白處理作陰性對照。實驗分為3組：上調(diào)組、下調(diào)組和NC組。脂肪細胞因子脂聯(lián)素(adiponectin，APN，ADIPOQ)、Krüppel樣因子4(Krüppel-like factors, KLF4)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細胞趨化因子1 (monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、CCAAT /增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)總RNA提取后使用核酸定量分析儀分析RNA純度。合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Step One熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行PCR反應(yīng)。

1.3.9RNA提取及實時熒光PCR檢測 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit細胞及組織RNA提取試劑盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser試劑盒說明書進行操作。Real-time PCR按照TB GreenTMPremic Ex TaqTMⅡ說明書操作。以U6為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt的方法表示miR-455b-3p相對于內(nèi)參基因的定量。引物序列見表1。

表1 實驗相關(guān)引物序列

2 結(jié)果

2.1 患者的基本信息34例患者的基本臨床信息見表2。其中，與對照組比較，實驗組患者低密度脂蛋白和超敏C反應(yīng)蛋白升高，高密度脂蛋白和APN降低，差異有統(tǒng)計學意義。

表2 患者的基本信息

2.2 實驗組與對照組配對比較圖1為使用散點圖顯示兩組之間倍數(shù)變化和顯著性之間的關(guān)系。Y軸是-log10(P值)(較高的值表示較大的顯著性)，并且X軸是倍數(shù)變化，即log2(miRNAs的表達量)。確定為顯著的探針在polt上標記(FDRt檢驗<0.05)。圖中的紅點表示差異有統(tǒng)計學意義的miRNA。

圖1 實驗組與對照組配對比較的散點圖

2.3 miRNA芯片篩選出的DE-miRNAs熱圖結(jié)果圖2為CAD(n=4)與對照(n=3)中差異表達的miRNA的分層聚類(差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05和差異倍數(shù)>2倍)。Columns顯示EAT樣品的聚類，行顯示基因的聚類。每個樣品中每種miRNA的表達強度從紅色變?yōu)榫G色，這分別表示相對高或低的表達。在圖的側(cè)面描繪了代表上調(diào)至下調(diào)的不同模式的表達簇。

2.4 實驗組和對照組EAT及血清中miR-455b-3p表達水平qRT-PCR驗證結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-455b-3p在實驗組EAT組織和血清中表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

2.5 miR-455b-3p與APN和FABP4 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補結(jié)合位點選取PicTar(http://pictar.org/)、miRGen(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_50//)、miRWalk(http://www.microrna.org/microrna/)和miRDB(http：// mirdb.org / miRDB /)四個預(yù)測網(wǎng)站進行。為了減少軟件預(yù)測的假陽性，取至少同時滿足2個預(yù)測軟件的基因才能作為靶基因。圖4為預(yù)測出的結(jié)合位點。

2.6 miR-455b-3p表達譜3T3-L1前脂肪細胞誘導8 d后使用油紅O染色鑒定誘導效率(圖5)。3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)過雞尾酒法誘導后分別于誘導0、2、4、6、8 d檢測miR-455b-3p的表達(圖6A)。

圖2 差異miRNA分層聚類熱圖

圖3 實驗組與對照組EAT和血清中miR-455b-3p表達水平A：EAT中miR-455b-3p表達水平；B：血清中miR-455b-3p表達水平；1：實驗組； 2：對照組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖4 miR-455b-3p與APN 3′-UTR結(jié)合位點

圖5 誘導8 d后油紅O染色 ×200A： 3T3-L1前脂肪細胞；B：油紅O染色結(jié)果

2.7 miR-455b-3p對APN及脂肪細胞因子表達影響分別在脂肪細胞誘導分化成熟0、2、4、6、8 d時檢測miR-455b-3p在3T3-L1細胞中的表達，結(jié)果顯示miR-455b-3p呈先增多后減少并在8 d時達到最高的趨勢(圖6A)；miR-455b-3p轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞在轉(zhuǎn)染后2 d通過qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，miR-455b-3p表達為轉(zhuǎn)染前約15倍(圖6B)。對已誘導成熟的3T3-L1脂肪細胞轉(zhuǎn)染miR-455b-3p模擬物，與NC組比較，上調(diào)組3T3-L1脂肪細胞中APN、KLF4 mRNA表達減少，IL-6、MCP-1 mRNA表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(圖7A)；下調(diào)組3T3-L1脂肪細胞中APN、KLF4 mRNA表達水平升高，IL-6、MCP-1 mRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(圖7B)。

圖6 miR-455b-3p表達譜及轉(zhuǎn)染效率

A：miR-455b-3p在脂肪細胞分化過程中表達譜；B：miR-455b-3p轉(zhuǎn)染效率；1：NC組；2：上調(diào)組；3：下調(diào)組

2.8 miR-455b-3p促進脂肪細胞分化成熟如油紅O染色(圖8)所示，與NC組比較，上調(diào)組分化第8天時在脂滴積累較對照組增多，脂肪形成標記基因PPARγ、C/EBPα的mRNA表達水平升高(圖9)。

3 討論

21世紀以來，冠心病是歐洲、美國以及亞洲國家導致死亡的最主要原因，占世界死亡人數(shù)的近三分之一。CAD的發(fā)生發(fā)展與脂代謝紊亂密切相關(guān)。EAT是一種位于心肌和心包臟層之間獨特的內(nèi)臟脂肪組織，EAT和心肌具有相同的微循環(huán)，這表明這兩種結(jié)構(gòu)之間有緊密的相互作用[4]。研究[5]表明EAT厚度是CAD獨立危險因素，其厚度和代謝活性與CAD的嚴重程度呈正相關(guān)性，在CAD患者中，增厚的EAT可能通過分泌促炎性細胞因子和其他機制促進斑塊的發(fā)展。

圖7 miR-455b-3p對脂肪細胞因子表達影響

A：上調(diào)組脂肪細胞因子的表達量；B：下調(diào)組脂肪細胞因子的表達量； 1：APN；2：KLF4；3：IL-6；4：MCP-1；與NC組比較：*P<0.05

圖8 雞尾酒法誘導3T3-L1前脂肪細胞8 d后油紅O染色鑒定 ×100A：3T3-L1前脂肪細胞；B：上調(diào)組油紅O染色結(jié)果

APN是一種脂肪細胞因子，對不同類型細胞具有提高胰島素敏感性、抗脂毒性、抗凋亡和抗炎作用，被認為是具有保護作用的生物活性蛋白質(zhì)[6]。APN通過直接影響血管成分細胞(包括巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞)的行為來預(yù)防動脈粥樣硬化進展。本研究顯示，CAD患者EAT中高表達的miR-455b-3p靶向調(diào)控APN表達。因此以miR-455b-3p為切入點，觀察其對APN的調(diào)控、對脂肪細胞因子表達以及對脂肪細胞分化的影響。

圖9 miR-455b-3p對脂肪標志基因影響

A：上調(diào)組脂肪分化標志物的表達量；B：下調(diào)組脂肪分化標志物的表達量；1：PPARγ；2：C/EBPα；3：FABP4；與NC組比較：*P<0.05

miRNAs是一種具有調(diào)節(jié)功能的RNA，通過與對應(yīng)的靶信使RNA(mRNA)特異性結(jié)合來直接降解靶mRNA，從而抑制靶mRNA的翻譯，進行基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[7]。miRNAs在脂肪組織中表達有差異，因此被認為是代謝紊亂、CAD、2型糖尿病的診斷和治療潛在生物學標志物[8]。近年來，人們對miRNA在脂肪細胞發(fā)育和肥胖的研究越來越深入[9]。研究[10]顯示miR-183通過靶向Smad4級聯(lián)調(diào)節(jié)PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c和FAS，從而促進脂肪細胞分化。最近研究[11]表明，將miR-17-5p抑制劑尾靜脈注入動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)后，動脈血管組織中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平有所降低。本研究顯示，CAD患者的EAT和血清中miR-455b-3p高表達，高表達的miR-455b-3p可能通過調(diào)控APN和FABP4，從而引起脂代謝紊亂和炎癥，并且促進脂肪細胞分化成熟。

肥胖既是心血管疾病的獨立危險因素，也與其他幾種危險因素密切相關(guān)。脂肪細胞分化與人體肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。脂肪分化過程由幾種轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行高度程序化調(diào)控，包括CCAAT /增強子結(jié)合蛋白(C / EBP)基因家族和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)[12], 在這些因子中，最主要的是PPARγ和C/EBPα。

動脈粥樣硬化是動脈血流中內(nèi)皮層紊亂、單核細胞遷移至血管壁并分化為巨噬細胞及泡沫細胞的炎性反應(yīng)[13]。KLF4是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，KLF4能夠激活I(lǐng)L-10基因的表達，起到抗炎作用[14]。IL-6主要通過其介導的信號通路促進炎癥反應(yīng)，是一種目前已知的炎癥因子[15]。MCP-1也稱為趨化因子(CC基序)配體2(CCL2)，參與炎癥、傷口愈合、纖維化和血管形成過程。

綜上，在冠心病心外膜脂肪組織中，脂代謝紊亂可能間接上調(diào)miR-455b-3p表達，而miR-455b-3p靶向調(diào)控APN表達，從而影響KLF4、IL-6和MCP-1等脂肪細胞因子分泌，導致其表達紊亂。同時miR-455b-3p能夠促進脂肪細胞分化成熟，促進EAT在心外膜沉積及體積增多，從而引起CAD的發(fā)生發(fā)展，但其具體機制尚待進一步探究。