張 磊，紀(jì)洵敏，蘇志堅(jiān)，唐 芮，蒲俏虹，彭拓華，張吉?jiǎng)P

睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig cell)是哺乳動(dòng)物睪丸間質(zhì)中的一種內(nèi)分泌細(xì)胞，具有合成和分泌睪酮的功能，是男性體內(nèi)雄激素的最主要來(lái)源[1]，具有促進(jìn)胚胎期生殖器官的分化發(fā)育、形成和維持男性第二性征，促使精子發(fā)生與成熟，激發(fā)性欲，維持性功能以及調(diào)節(jié)人體的新陳代謝(如蛋白質(zhì)合成、骨骼生長(zhǎng)及紅細(xì)胞生成等)等極其重要的生理功能[2]。近幾十年來(lái)，伴隨著全球老齡化問(wèn)題的加劇，中老年男性部分性激素缺乏綜合征引起的社會(huì)問(wèn)題日益突出，而傳統(tǒng)的激素治療方法存在嚴(yán)重不足，因而迫切需要開(kāi)發(fā)全新的生物相容性高的替代治療方法。在這種形勢(shì)下，睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生分化的研究逐漸成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)。

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)于1962年首次在小鼠的頜下腺中發(fā)現(xiàn)[3]。EGF是由53個(gè)氨基酸組成的多肽單鏈，分子量為6 045，EGF的生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)與其受體(EGFR)結(jié)合而發(fā)揮作用的。它是一種促細(xì)胞分裂劑，能加速核酸和蛋白質(zhì)的合成,從而促進(jìn)多種細(xì)胞分裂增殖，并影響細(xì)胞的分化[4]。近年來(lái)，研究顯示EGF與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化功能存在密切關(guān)系[5]，但是缺乏直接的研究證據(jù)，由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞株和原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞存在的缺陷和不足[6]，該研究采用課題組構(gòu)建的二甲磺基乙烷(ethylene dimethanesulfonate，EDS)處理曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型[7]來(lái)探討EGF在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的再生分化過(guò)程中對(duì)其增殖和分化的影響，目前國(guó)內(nèi)開(kāi)展這方面的研究較少，該模型直觀地反映了EGF在睪丸間質(zhì)干細(xì)胞再生增殖分化中的作用，為研究EGF在治療中老年男性部分性激素缺乏綜合征中的功能和作用提供了重要的研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器SD大鼠(約150 g)購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；EDS由中山大學(xué)化工學(xué)院龐冀燕老師合成；睪酮放射免疫分析藥盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；EGF購(gòu)自美國(guó)RD公司；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(insulin-transferrin-sodium selenium,ITS，I1884)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH，L9773)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Click-iT?EdU HCS Assays(C10350)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；24孔板(3156)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；熒光定量PCR儀、熒光染料 SsoAdvacedTMSYBR?Green(172-5261)以及DNA合成試劑盒iScript cDNA Synthesis(170-8890)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；RNA抽提試劑盒RNeasy?Plus Mini Kit(74134)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；本實(shí)驗(yàn)所有引物由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1曲細(xì)精管體外模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[8]，雄性SD大鼠實(shí)驗(yàn)前7 d腹腔注射EDS(75 mg/kg)，CO2處死后，將睪丸取出，置于冰冷的D-PBS中，剪除被膜，血管與曲細(xì)精管剝離，將曲細(xì)精管分離成單根，于DMEM/F12培養(yǎng)基中(0.1% BSA和ITS)34 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1中的方法提取分離大鼠曲細(xì)精管，構(gòu)建曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型。次日，將曲細(xì)精管分至24孔板，加入細(xì)胞因子處理曲細(xì)精管，分組為ITS組(DMEM/F12培養(yǎng)基中加入0.1% BSA和ITS)、LH組(ITS組加入LH，LH終濃度為10 ng/ml)、EGF100組(ITS組加入EGF，EGF終濃度為100 ng/ml)和EGF10組(ITS組加入EGF，EGF終濃度為10 ng/ml)，處理24 h后，Click-iT?EdU HCS Assays試劑盒進(jìn)行5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)染色，具體操作說(shuō)明參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1中的方法提取分離大鼠曲細(xì)精管，構(gòu)建曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型。次日，將曲細(xì)精管分至24孔板，加入細(xì)胞因子處理，EGF的濃度為100 ng/ml、10 ng/ml，LH濃度為10 ng/ml，處理時(shí)間為72 h，而后將含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基更換為含LH的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至21 d，每3.5 d更換1次培養(yǎng)基，收集第14天和第21天的培養(yǎng)基上清液待測(cè)睪酮，收集第14天和第21天樣品提取RNA，熒光定量PCR檢測(cè)睪酮合成通路上相關(guān)酶的表達(dá)情況，基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGF對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)干細(xì)胞促增殖作用EdU染色方法檢測(cè)大鼠睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果見(jiàn)圖1，在經(jīng)過(guò)LH和EGF處理24 h后，在曲細(xì)精管的表面出現(xiàn)了大量的紡錘形的、EdU標(biāo)記的細(xì)胞。與ITS組比較，LH組能夠顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的大量增殖(t=10.35，P<0.000 1)，EGF100組能夠顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖(t=12.61，P<0.01)，而EGF10組雖然也能顯著促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖(t=6.51，P<0.01)，但是與EGF100組比較，其作用效果明顯要弱。EGF能夠促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并且其作用效果呈現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

2.2 EGF對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)干細(xì)胞促分化作用檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分化的重要指標(biāo)-睪酮的分泌情況，從圖2中可以看出，經(jīng)過(guò)3 d的EGF處理后，換為含LH的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至21 d，與ITS組比較，EGF100組能夠顯著地促進(jìn)睪酮的產(chǎn)生(t=6.05，P<0.01)，EGF10組也能夠顯著地促進(jìn)睪酮的產(chǎn)生(t=3.46，P<0.01)，表明EGF能夠誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞向睪丸間質(zhì)細(xì)胞方向的分化，而LH組則沒(méi)有明顯地促進(jìn)睪酮的產(chǎn)生(t=0.85，P<0.01)。

2.3 睪酮合成過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)情況如圖3所示，EGF誘導(dǎo)3 d后，加入含有1 ng/ml LH的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)11 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGF能夠影響幾個(gè)基因在mRNA水平的表達(dá)。對(duì)于Star基因，與ITS組比較，LH組能夠顯著促進(jìn)Star基因的表達(dá)(P=0.000 5)， EGF100組和EGF10組也能顯著促進(jìn)該基因的表達(dá)(P=0.000 6、0.000 5)，并且與LH組比較， EGF100組的誘導(dǎo)表達(dá)作用要明顯更強(qiáng)(P=0.000 3)；對(duì)于Hsd3b1基因，EGF的誘導(dǎo)表達(dá)的作用與Star基因相似，與ITS組比較，LH組、EGF100組和EGF10組均能顯著地促進(jìn)Hsd3b1基因的表達(dá)(P=0.000 1、P<0.000 1、P<0.000 1)，并且與LH組比較， EGF100組的誘導(dǎo)表達(dá)作用要更強(qiáng)(P=0.013 3)；位于細(xì)胞線(xiàn)粒體上的Cyp11a1基因在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分化是一個(gè)非常明顯的標(biāo)志物，在睪酮合成過(guò)程中也是非常重要的一個(gè)中間酶，與ITS組比較，EGF100組能夠明顯促進(jìn)Cyp11a1基因的表達(dá)(P<0.000 1)，并且與LH組比較，其誘導(dǎo)表達(dá)要明顯更強(qiáng)(P=0.000 2)；作為睪丸間質(zhì)細(xì)胞從睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞階段向未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞階段分化的典型標(biāo)志物基因Hsd17b3與前幾個(gè)基因的表達(dá)存在差異，與ITS組比較，EGF100組和EGF10組均沒(méi)有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)作用(P=0.899 0，P=0.361 7)；對(duì)于Srd5a1基因，與ITS組比較，EGF100組和EGF10組具有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)作用(P=0.000 3、P=0.007 1)。

圖1 曲細(xì)精管的EdU染色

A：EdU染色×100；B：增殖細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析；a：ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：***P<0.001

圖2 曲細(xì)精管培養(yǎng)21 d時(shí)培養(yǎng)基上清液中睪酮的分泌情況

A：ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：*P<0.05,***P<0.001

3 討論

成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分化主要包括四個(gè)階段：睪丸間質(zhì)干細(xì)胞、睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞、未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞和成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞[9]。研究[10]顯示，從出生后7 d的雄性大鼠睪丸內(nèi)能夠分離到睪丸間質(zhì)干細(xì)胞，并且這些細(xì)胞主要位于曲細(xì)精管的表面。在成年大鼠睪丸內(nèi)，成年的睪丸間質(zhì)細(xì)胞一旦成熟，將不會(huì)再增殖分化。然而，當(dāng)成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞被特異性的抑制劑EDS殺死后，新的睪丸間質(zhì)細(xì)胞就會(huì)生成[11]。

大量研究[12]顯示EGF能夠顯著地影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的能力。但是EGF對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響少有報(bào)道。在本研究所構(gòu)建的曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型中，EGF能夠顯著地促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中Star、Hsd3b1、Cyp11a1和Hsd17b3等幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)，表明其具有明顯地促分化作用，這與研究中睪酮的檢測(cè)情況是一致的。促增殖作用方面，100 ng/ml和10 ng/ml EGF均能顯著地誘導(dǎo)EdU標(biāo)記陽(yáng)性的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖，但是在曲細(xì)精管培養(yǎng)體系中，出現(xiàn)增殖的不止睪丸間質(zhì)干細(xì)胞，還包括精原細(xì)胞和精細(xì)胞系的多種細(xì)胞，精原細(xì)胞和精細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)及其所處位置均與睪丸間質(zhì)干細(xì)胞不同。

圖3 睪酮合成通路幾個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況

A：Star; B: Cypllal; C:Hsd3β1;D:Hsd17β3;E:Srd5a1;ITS組；b：LH組；c：EGF100組；d：EGF10組；與ITS組比較：**P<0.01，***P<0.001

本研究首次在體外組織培養(yǎng)體系中證實(shí)了EGF的直接促增殖和促分化作用，近幾年，許多研究結(jié)果也間接證明了EGF對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用。Pan et al[5]通過(guò)運(yùn)用RT-PCR、Western blot和免疫組化技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)EGF和EGFR在牦牛睪丸的發(fā)育精子生成過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用；Tamada et al[13]研究發(fā)現(xiàn)犬類(lèi)睪丸中EGF及其受體主要在曲細(xì)精管上表達(dá)，并且在mRNA水平上隨著年齡的增加EGF受體逐漸減少而EGF沒(méi)有顯著變化，表明EGF及其受體在犬類(lèi)睪丸發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用；He et al[14]研究顯示，新生的公羊駝睪丸并沒(méi)有EGF表達(dá)，而到了青春期、性成熟期，睪丸中EGF在生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞才有明顯表達(dá)；宋衛(wèi)儒 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGF在食蟹猴睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)存在差異，以新生猴期最低，而后各個(gè)發(fā)育時(shí)期EGF表達(dá)量升高。

綜上所述，利用曲細(xì)精管體外培養(yǎng)模型，本研究在mRNA水平和酶學(xué)水平均直接證明了EGF對(duì)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的作用，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將為治療中老年男性雄激素部分缺乏綜合征(PADAM)提供非常重要的線(xiàn)索，即可將EGF作為治療PADAM的候選藥物，開(kāi)發(fā)生物源性雄激素補(bǔ)充藥物或睪丸間質(zhì)細(xì)胞再生替代等全新的治療方法。