羅曉荷，陳 剛，王宜梅，王 煒，朱 飛

再生醫(yī)學(xué)作為極具潛力的新興醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過(guò)修復(fù)、替換或再生器官和組織的方式恢復(fù)受損組織的功能[1]。人類具有有限的再生修復(fù)組織和器官的能力，當(dāng)周圍神經(jīng)損傷后即發(fā)生華勒變性(wallerian degeneration,WD)，損傷處殘存的雪旺細(xì)胞(schwann cells，SCs)的數(shù)量和增殖分化能力是影響神經(jīng)再生修復(fù)的關(guān)鍵因素。在此過(guò)程中SCs去分化，分泌大量生長(zhǎng)因子，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和髓鞘形成，從而促進(jìn)神經(jīng)的再生修復(fù)[2]。同時(shí)，受損的周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和其他炎癥因子，參與一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。既往研究[3-4]證明IL-1β在組織再生過(guò)程中發(fā)揮多種作用。例如促進(jìn)血管平滑肌的增殖，促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖等。由此推斷，除了參與WD中的免疫應(yīng)答作用，IL-1β對(duì)SCs的增殖和凋亡也具有一定影響。該研究將觀察周圍神經(jīng)系統(tǒng)WD早期IL-1β對(duì)SCs增殖和凋亡的影響，并探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量220～260 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑 胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；三抗(100×青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；重組大鼠IL-1β購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板、90 mm培養(yǎng)皿、50 ml離心管購(gòu)自美國(guó)BD公司；RIPA裂解液購(gòu)自連云港碧云天公司；anti-Ki67 antibody、anti-Bax antibody、anti-Bcl-2 antibody購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Tunel法凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.1.3主要儀器 儀器：流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)HERAEUS公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；立體解剖顯微鏡購(gòu)自日本Carl Zeiss Jena公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；離心機(jī)購(gòu)自上海手術(shù)器械公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1體外WD模型的制備 參照Thomson et al[5]于1993年報(bào)道的vitroWallerian degeneration制備方法，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行了改進(jìn)所制備的體外WD模型。制備過(guò)程：將6～8周齡健康雄性SD大鼠麻醉后處死，75%酒精浸泡消毒，于超凈臺(tái)俯臥位固定，暴露坐骨神經(jīng)全長(zhǎng)，切取大鼠坐骨神經(jīng)全長(zhǎng)，立體解剖顯微鏡下去除神經(jīng)外膜，將神經(jīng)分成絮狀神經(jīng)絲，置于含10%胎牛血清FBS和100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、0.25 mg/ml兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.2.2免疫熒光染色法檢測(cè)增殖標(biāo)記Ki67表達(dá)情況 將去除神經(jīng)外膜的大鼠坐骨神經(jīng)組織離體后于體外WD模型中培養(yǎng)，給予不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)。干預(yù)培養(yǎng)48 h，收集坐骨神經(jīng)組織樣本，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛固定15 min；棄除固定液，PBS洗滌3次；1%BSA封閉液封閉60 min；加入200 μl Ki67一抗(1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次；加入熒光標(biāo)記的二抗，避光37 ℃孵育60 min；PBS洗滌3次；加入DAPI(1 ∶1 000)避光37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.3Tunel法細(xì)胞凋亡染色 去除神經(jīng)外膜的大鼠坐骨神經(jīng)組織離體后于體外WD模型中培養(yǎng)，給予不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)。干預(yù)培養(yǎng)48 h，收集坐骨神經(jīng)組織樣本，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛固定15 min；棄除固定液，PBS洗滌3次；用0.1%枸櫞酸鈉緩沖液配0.1%的Triton X-100，冰上孵育2 min；PBS浸泡3次；加入Tunel反應(yīng)液，37 ℃避光孵育1 h；PBS避光浸泡2次；DAPI染核，37 ℃避光孵育30 s；PBS避光浸泡3次；熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，Tunel試劑標(biāo)記紅色和DAPI標(biāo)記的藍(lán)色同時(shí)陽(yáng)性才被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。

1.2.4Western blot檢測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)蛋白表達(dá) 去除神經(jīng)外膜的大鼠坐骨神經(jīng)組織經(jīng)體外WD模型中不同濃度IL-1β干預(yù)(0 ng/ml和5 ng/ml)后24 h收集樣本，提取組織總蛋白，通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度并調(diào)整樣品蛋白濃度后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯PVDF膜，放入5%BSA中封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，顯影儀掃描。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β對(duì)體外WD模型中SCs增殖的影響不同濃度IL-1β干預(yù)培養(yǎng)48 h后，免疫熒光標(biāo)記的Ki67均主要位于細(xì)胞核內(nèi)；5 ng/ml濃度的IL-1β干預(yù)后，大鼠坐骨神經(jīng)組織中SCs Ki67表達(dá)量較0 ng/ml濃度組有所升高(圖1)。統(tǒng)計(jì)兩組SCs的Ki67陽(yáng)性率顯示，5 ng/ml濃度組Ki67陽(yáng)性率較0 ng/ml濃度組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度IL-1β干預(yù)后SCs Ki67陽(yáng)性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞比例

2.2 IL-1β對(duì)體外WD模型中SCs凋亡的影響Tunel陽(yáng)性主要位于細(xì)胞核內(nèi)；5 ng/ml IL-1β干預(yù)48 h后，大鼠坐骨神經(jīng)組織中SCs Tunel表達(dá)量較0 ng/ml濃度組有所降低，見(jiàn)圖2。統(tǒng)計(jì)兩組SCs的Tunel陽(yáng)性率顯示，5 ng/ml濃度組Tunel陽(yáng)性率較0 ng/ml濃度組降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 IL-1β對(duì)體外WD模型中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況的影響不同濃度IL-1β干預(yù)培養(yǎng)24 h后，用Western blot檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)組織樣本中Bax和Bcl-2表達(dá)量，并以β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別檢測(cè)5 ng/ml濃度組和0 ng/ml濃度組體外WD模型中Bcl-2和Bax表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析兩組體外WD模型中Bcl-2和Bax表達(dá)量差異，見(jiàn)圖3、表2：5 ng/ml濃度組較0 ng/ml濃度組SCs凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)量升高(P<0.05)；5 ng/ml濃度組較0 ng/ml濃度組凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量降低(P<0.05)。這與Tunel法凋亡染色結(jié)果一致。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)Bcl-2/Bax比例的差異，分析顯示，5 ng/ml組較0 ng/ml組中SCs凋亡抑制蛋白Bcl-2/凋亡促進(jìn)蛋白Bax表達(dá)量比例升高(P<0.05)。

表2 不同濃度IL-1β干預(yù)后SCs中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量及其比值

圖1 不同濃度IL-1β干預(yù)48 h后SCs Ki67表達(dá)情況 A：免疫熒光染色×100；B：SCs Ki67陽(yáng)性率;與0 ng/ml組比較：**P<0.01

圖2 不同濃度IL-1β干預(yù)48 h后SCs凋亡情況A：免疫熒光染色×100；B：SCs Tunel陽(yáng)性率；與0 ng/ml組比較：*P<0.05

圖3 不同濃度IL-1β干預(yù)24 h后SCs中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況A：Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)； B： Bcl-2；C： Bax; D： Bcl-2/Bax；與0 ng/ml組比較：*P<0.05

3 討論

在周圍神經(jīng)損傷發(fā)生WD的過(guò)程中，損傷處殘存的SCs自發(fā)去分化和增殖，促進(jìn)髓鞘形成和軸突再生。同時(shí)，受損的周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的IL-1β等多種炎癥因子在神經(jīng)損傷修復(fù)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。既往研究[6]表明IL-1β可增加損傷區(qū)域SCs神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)量，促進(jìn)神經(jīng)元存活及軸突生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞清除髓鞘碎片，從而促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。但I(xiàn)L-1β對(duì)SCs增殖和凋亡作用的研究鮮有報(bào)道。

Ki67是一種核抗原，作為細(xì)胞增殖的特異性和敏感性標(biāo)志物，是檢測(cè)細(xì)胞增殖的可靠指標(biāo)。Ki67在G0期和G1早期無(wú)表達(dá)，于G1中后期開(kāi)始表達(dá)，位于細(xì)胞核周圍區(qū)，S期、G2期表達(dá)逐漸增加，M期達(dá)到峰值[7]。本研究通過(guò)免疫熒光染色標(biāo)記坐骨神經(jīng)WD早期過(guò)程中SCs Ki67，并量化分析IL-1β干預(yù)前后其表達(dá)的陽(yáng)性率差異。本研究顯示適當(dāng)濃度IL-1β干預(yù)后SCs Ki67表達(dá)量增加，Ki67陽(yáng)性率升高，可見(jiàn)IL-1β具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)WD早期SCs增殖的作用。

檢測(cè)細(xì)胞增殖情況后，本研究進(jìn)一步采用Tunel法凋亡細(xì)胞染色檢測(cè)并分析IL-1β干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率差異。結(jié)果顯示適當(dāng)濃度IL-1β可降低坐骨神經(jīng)WD早期SCs凋亡率，抑制其細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞自主的程序性死亡。通常，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡是確定細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)[8]。Bcl-2蛋白家族則在其中扮演著重要角色，根據(jù)對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的不同及同源結(jié)構(gòu)的不同，將Bcl-2蛋白家族分為3個(gè)亞組，一組具有抗凋亡作用，其他兩組具有促凋亡作用， Bax和Bcl-2是該家族的主要成員，其在人體細(xì)胞中的作用受到廣泛關(guān)注[9]。Bax和Bcl-2是同源基因，Bcl-2具有抗細(xì)胞凋亡作用。Bax是Bcl-2的拮抗基因，對(duì)Bcl-2具有拮抗作用。Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與Bcl-2和Bax比例的變化密切相關(guān)，兩者比例的改變決定了凋亡信號(hào)刺激后細(xì)胞發(fā)生凋亡或存活的最終命運(yùn)[10]。Bcl-2基因可在多種正常細(xì)胞的刺激和發(fā)育中表達(dá)，但在成熟或凋亡細(xì)胞中不表達(dá)或最低限度表達(dá)。研究[11]表明Bcl-2通過(guò)多種途徑聯(lián)合作用調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制主要包括：抑制促凋亡細(xì)胞色素C從線粒體釋放后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；抗氧化作用和維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡；阻止細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C激活caspase，抑制DNA裂解[12]。Bax是一種關(guān)鍵的促凋亡蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)，發(fā)生凋亡時(shí)，Bax易位到線粒體膜，形成同源二聚體促進(jìn)凋亡，當(dāng)與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)，凋亡作用則被抑制。

通過(guò)Western blot檢測(cè)顯示，適當(dāng)濃度IL-1β干預(yù)后WD早期抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量增加，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示適當(dāng)濃度IL-1β干預(yù)后WD早期SCs Bcl-2/Bax表達(dá)量比例升高。這與Tunel法凋亡細(xì)胞染色結(jié)果一致表明適當(dāng)濃度IL-1β可抑制坐骨神經(jīng)WD早期SCs的凋亡。

綜上所述，適當(dāng)濃度的IL-1β可以促進(jìn)WD早期SCs的增殖，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制SCs凋亡。該研究對(duì)探尋局部組織損傷后炎癥因子對(duì)組織再生的作用具有重要意義，為周圍神經(jīng)再生修復(fù)的治療提供理論基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步深入探討。其確切的作用機(jī)制是下一步研究的重點(diǎn)。