趙亞運，王鑫玲，朱云竹，葉 英

鮑曼不動桿菌(A.baumannii，AB)是引起醫(yī)院感染的條件致病菌[1]，2017年由中國CHINET細菌耐藥數(shù)據(jù)顯示[2]，鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南耐藥率在60%以上，替加環(huán)素成為治療的基石藥物。近年來的研究表明鮑曼不動桿菌的替加環(huán)素耐藥與外排泵系統(tǒng)有關(guān)，目前與鮑曼不動桿菌相關(guān)的外排泵系統(tǒng)共有5個家族，其中ATP結(jié)合盒家族的MacAB-tolC[3]和主要易化子超家族的外排泵EmrAB[4]已在其他菌中雖有報道，但在鮑曼不動桿菌中尚未進行詳細研究。迫切需要了解不同類型的外排泵基因在臨床分離的多重耐藥的鮑曼不動桿菌中的分布及表達量與抗菌藥物的關(guān)系。本研究探討外排泵基因的表達水平與鮑曼不動桿菌耐藥性的關(guān)系，尤其與替加環(huán)素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2017年9月份安徽地區(qū)10家三甲醫(yī)院臨床科室分離出的多重耐藥的鮑曼不動桿菌26株作為實驗組，篩選標準為3類或3類以上抗菌藥物均耐藥，選擇野生菌種ATCC17978作為標準菌株，2株誘導(dǎo)菌株由標準菌株分別經(jīng)過替加環(huán)素、亞胺培南誘導(dǎo)產(chǎn)生，分別命名為：17978TGC、17978IMP。所有菌株經(jīng)過法國梅里埃全自動生物檢定儀鑒定。

1.1.2替加環(huán)素及亞胺培南誘導(dǎo)耐藥菌株選擇 ATCC17978菌株替加環(huán)素誘導(dǎo)過程如下：接種單個菌落于含有0.5倍的ATCC17978替加環(huán)素最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)的LB肉湯培養(yǎng)液中，37 ℃，210 r/min，過夜，第2天，取10 μl過夜菌加入含1倍MIC濃度的LB培養(yǎng)液中，37 ℃,210 r/min，過夜，第3天重復(fù)前1 d操作，LB培養(yǎng)液含有2倍MIC濃度，連續(xù)誘導(dǎo)至64倍MIC為最終誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)株和原始菌株利用16rRNA、rpoB進行鮑曼不動桿菌菌種鑒定。亞胺培南誘導(dǎo)株及鑒定同上。

1.1.3主要儀器 細菌多點接種儀(英國AQSManufacturing公司)；PCR擴增儀(德國Biometra公司)；核酸電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像及分析系統(tǒng)(上海天能公司)；熒光定量PCR儀(LightCycler?96 System,瑞士羅氏公司)。

1.1.4主要試劑 哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南、多粘菌素、慶大霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。替加環(huán)素(美國輝瑞公司)；M-H瓊脂粉和藥敏紙片(英國Oxoid公司)；細菌基因組試劑盒(Tiagen)；RNA提取試劑盒、SYBR Green逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、PCR Master Mix、DNA marker DL2000均購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖及染料購自上海生工工程有限公司。

1.1.5引物合成 外排泵基因中的引物設(shè)計考文獻[5-6]委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1藥敏實驗 采用M-H瓊脂稀釋法進行MIC檢測，以大腸埃希菌標準菌(ATCC25922)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)作為質(zhì)控菌株，并以2017版美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)[7]的標準判斷抗菌藥物敏感性。通過肉湯稀釋法檢測MDR-AB臨床分離株對替加環(huán)素的敏感性，由于CLSI上無替加環(huán)素對不動桿菌的MIC折點解釋標準，參照歐洲藥敏試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)標準。解釋標準為：>2 μg/ml為耐藥；≤1 μg/ml為敏感。

1.2.2外排泵基因的檢測 按照細菌基因組試劑盒說明提取各株菌的基因組。PCR反應(yīng)體系及條件：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl， ddH2O 10.5 μl， DNA模板1 μl。以ddH2O為空白對照。第1步，94 ℃預(yù)熱變性5 min；第2步，95 ℃變性1 min，53 ℃～58 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min,進行30個循環(huán)；第3步，72 ℃延伸10 min；第4步，4 ℃靜止10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物取5 μl與0.5 μl 10×上樣緩沖液混合，用1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像儀上觀察結(jié)果保存。

1.2.3外排泵表型抑制試驗 將臨床菌株及誘導(dǎo)菌株作為研究對象，采用稀釋法，分別加入不同濃度的外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-苯胺(PAβN)進行篩選，比較菌株加入外排泵抑制劑前后對替加環(huán)素及亞胺培南MIC值的變化，其MIC較使用前下降4倍以上，判斷為外排泵陽性[8]。

1.2.4RT-PCR檢測外排泵基因的表達水平 取上一步篩選出的外排泵基因陽性的菌株進行實驗，并以標準菌株ATCC17978為對照組進行實驗。

1.2.4.1提取菌株RNA 挑選平板上單個菌落接種于4 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 210 r/min過夜，取40 μl的菌液加入4 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 210 r/min培養(yǎng)6～8 h，12 000 r/min離心1 min收菌液于無酶的EP管中，按照試劑盒操作說明書步驟提取細菌RNA，最后測其濃度。

1.2.4.2逆轉(zhuǎn)錄(冰上操作) 按照試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系如下：5×primescript buffer 4 μl， primescript RT Enzyme Mix I 1 μl， RT primer Mix 1 μl，RNase Free ddH2O和RNA Templet 共14 μl，總反應(yīng)體系20 μl。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件37 ℃、15 min，85 ℃、5 s， 4 ℃保存。

1.2.4.3熒光定量PCR 取逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA按照試劑盒說明進行熒光定量PCR，以管家基因rpoB[6]為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件及體系為：SYBR Premix Ex TaqII 12.5 μl,模板cDNA 2 μl, ddH2O 8.5 μl,總共25 μl。反應(yīng)步驟為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸50 s，共45個循環(huán)。使用Roche Lightcycler?96 System 配套軟件分析樣本中rpoB和外排泵基因的CT值，以2-ΔΔCt進行耐藥菌株間的外排泵基因表達水平進行分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感結(jié)果分析26株臨床分離的多重耐藥的鮑曼不動桿菌體外抗菌活性見表2。從表中可以看出，臨床分離的多重耐藥的鮑曼不動桿菌對臨床常用的頭孢類、青霉素類、氨基糖苷類、亞胺培南及美羅培南抗菌藥物耐藥率超過80%，米諾環(huán)素的耐藥率46.15%，頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉耐藥率46.16%以上，替加環(huán)素耐藥率11.55%，所有實驗菌株對多粘菌素均敏感。其中17978TGC對亞胺培南、美羅培南、多粘菌素敏感，其他抗菌藥物都產(chǎn)生不同程度的耐藥，17978IMP中除米諾環(huán)素、替加環(huán)素、多粘菌素都敏感，其他藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥。

表2 26株鮑曼不動桿菌對18種抗菌藥藥敏實驗結(jié)果[n(%)]

注:在CLSI瓊脂稀釋和紙片擴散法中以無頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉的折點為判斷標準，本研究K-B紙片擴散法采用頭孢哌酮對銅綠假單胞菌的敏感性判斷標準；即S：≥21 mm，I：16～20 mm，R：≤15 mm

2.2 外排泵基因的檢測結(jié)果26株臨床分離株中20株菌均檢出了adeB(571 bp)、adeJ(471 bp)、abeM(460 bp)、abeS(148 bp)、macB(540 bp)、emrB(570 bp)、craA(930 bp)，并經(jīng)過了測序確認，2株誘導(dǎo)菌株全部測出以上外排泵基因，從數(shù)據(jù)上可以了解到多重耐藥的鮑曼不動桿菌中均有外排泵基因分布，其中macB、emrB的檢出率在90%以上。部分菌株外排泵基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.3 外排泵抑制試驗經(jīng)預(yù)實驗篩選后，添加PAβN (50 mg/L)后,3株替加環(huán)素耐藥菌株的MIC值下降了4～8倍,26株碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌中13株的MIC下降了4～16倍以上,2株誘導(dǎo)耐藥菌株的MIC下降了16倍。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖M：DNA Marker；1～5：鮑曼不動桿菌；6：空白對照

2.4 外排泵基因mRNA表達水平和抗菌藥物之間的關(guān)系本實驗所用菌株與標準菌株主動外排泵基因adeB、adeJ、adeS的mRNA表達量具有明顯的差異且具有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)，部分菌株外排泵基因的mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義但表達量高于標準株。由于多重耐藥的鮑曼不動桿菌抗菌藥物選擇壓力，替加環(huán)素和亞胺培南是臨床治療多重耐藥的鮑曼不動桿菌的首選藥物，因此選擇替加環(huán)素和亞胺培南作為分析用來反映外排泵的表達量和抗菌藥物的關(guān)系，3株替加環(huán)素耐藥菌株中adeB(P<0.05)、adeJ(P<0.05)、macB(P<0.05)的表達量高于標準菌株(圖2)，亞胺培南耐藥菌株中adeB(P<0.05)、adeJ(P<0.05)表達明顯高于標準菌株(圖3)。

表3 多重耐藥的鮑曼不動桿菌和誘導(dǎo)耐藥菌株外排泵基因mRNA的表達量

17978TGC：替加環(huán)素誘導(dǎo)耐藥菌株；17978IMP：亞胺培南誘導(dǎo)菌株； 與17978組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 替加環(huán)素耐藥菌株和敏感菌株外排泵基因的表達量A：adeB基因；B：adeJ基因；C:abeS基因；D:abeM基因；E: macB基因；F：emrB基因；G：CraA基因；與敏感菌株比較：*P<0.05

圖3 亞胺培南耐藥菌株和敏感菌株外排泵基因的表達量A：adeB基因；B：adeJ基因；C:abeS基因；D:abeM基因；E: macB基因；F：emrB基因；G：CraA基因；與敏感菌株比較：**P<0.01

3 討論

鮑曼不動桿菌是一種需氧的革蘭陰性條件致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中，由于具有較強的存活力和抵抗力，鮑曼不動桿菌的感染已經(jīng)成為全球醫(yī)院需要解決的難題。本實驗收集的26株臨床分離的多重耐藥的鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥，其中碳青霉烯類亞胺培南和美羅培南為100%耐藥，頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率比較相近，氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星耐藥率較慶大霉素低，喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星耐藥率較環(huán)丙沙星低，上述結(jié)果證實了多重耐藥的鮑曼不動桿菌對多粘菌素和替加環(huán)素保持較高的敏感性。2株誘導(dǎo)菌株與標準菌株相比對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物均產(chǎn)生了耐藥。本實驗收集的菌株均對多粘菌素敏感。鮑曼不動桿菌在亞胺培南、替加環(huán)素的作用下可以發(fā)展成為多重耐藥，并同時對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類等抗菌藥物也耐藥。

目前在鮑曼不動桿菌中報道的有AdeABC、AdeIJK[9]、AdeFGH[10]、AdeDE[11]、AdeXYZ、AbeM、AbeS等主動外排泵系統(tǒng)。本實驗探討了在鮑曼桿菌ATP結(jié)合盒家族MacAB-tolC外排泵基因macB和主要易化子超家族EmrAB外排泵基因emrB，其中macB基因[3]的表達上調(diào)和替加環(huán)素的耐藥有關(guān)，Lin et al[4]發(fā)現(xiàn)emrB基因敲除的鮑曼不動桿菌比野生株對多粘菌素更敏感。結(jié)果顯示，外排泵基因adeB、adeJ、abeM、abeS、macB、emrB、craA[12]廣泛分布于臨床分離株中， 3株臨床分離的替加環(huán)素耐藥菌加入替加環(huán)素與PAβN后MIC下降了4～8倍，誘導(dǎo)耐藥菌株下降了8倍，表明外排泵在替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動桿菌有一定的作用，在轉(zhuǎn)錄水平中macB和adeB、adeJ的表達明顯高于標準菌株，替加環(huán)素誘導(dǎo)耐藥菌株中adeB的表達水平高于耐藥菌株。同時驗證了Lee et al[13]報道的adeB基因的表達水平可反映外排泵AdeABC基因的過表達是鮑曼不動桿菌對碳青酶烯類耐藥的一個機制。本研究尚未發(fā)現(xiàn)abeM[14]在亞胺培南耐藥菌中的作用，但發(fā)現(xiàn)了在多重耐藥的鮑曼不動桿菌中adeJ基因高表達。本實驗收集的菌株均對多粘菌素敏感，因此emrB基因的表達量相對較低。由于鮑曼不動桿菌耐藥機制比較復(fù)雜，除外排泵基因外還有產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白改變、青霉素結(jié)合蛋白位點的改變、生物被膜形成、核糖體保護機制[15]等。因此鮑曼不動桿菌的耐藥機制仍需要進一步研究。

綜上，在抗菌藥物大量使用的壓力下使細菌固有的主動外排系統(tǒng)表達增強，其質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、耐藥島等遺傳元件在不同細菌之間廣泛的傳播，使主動外排泵基因等水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多重耐藥的鮑曼不動桿菌發(fā)生迅速播散，通過主動外排系統(tǒng)的研究可以為臨床鮑曼不動桿菌耐藥機制提供新的科學(xué)依據(jù)。由于主動外排泵的機制比較復(fù)雜，種類繁多，多個外排泵之間可以相互作用，本文通過分析了多重耐藥的鮑曼不動桿菌與外排泵之間的關(guān)系，旨在為臨床抗菌藥物及非抗菌藥物的研發(fā)提供新的靶點。