劉浩波，劉 濤，王亞雷，羅昭鋒

胃癌(stomach cancer，SC)是世界上第四大常見(jiàn)的惡性腫瘤, 發(fā)病率逐年上升[1]，但其早期癥狀并不明顯，大多數(shù)SC患者就診時(shí)就已發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移, 延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。因此如果能鑒定出高轉(zhuǎn)移性SC的腫瘤標(biāo)志物將對(duì)早期監(jiān)測(cè)SC轉(zhuǎn)移和探索SC轉(zhuǎn)移機(jī)制帶來(lái)巨大前景。

目前，尋找腫瘤標(biāo)志物一種方法是使用抗體，另一種是使用適配體，通過(guò)抗體尋找靶蛋白時(shí)，需要兩種抗體形成一種特殊結(jié)構(gòu)才能找到靶標(biāo)蛋白[2]，使用核酸適配體來(lái)尋找生物標(biāo)志物的方法相對(duì)簡(jiǎn)單。核酸適配體是由隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)通過(guò)寡核苷酸與靶分子的重復(fù)結(jié)合演化而來(lái)的單鏈DNA或RNA分子。與抗體類(lèi)似，適配體可以以高特異性和親和力結(jié)合其靶分子。該研究旨在利用已經(jīng)得到的可以特異性識(shí)別高轉(zhuǎn)移SC細(xì)胞的適配體LW-25去探索其結(jié)合的靶標(biāo)蛋白。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞系HGC-27(高轉(zhuǎn)移能力)獲贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院；生長(zhǎng)于含20 U/ml的青霉素和鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2條件下恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.1.2單鏈DNA序列名稱(chēng)及堿基組成 見(jiàn)表1。

表1 生物素修飾后的LW-25及隨機(jī)文庫(kù)Lib的堿基組成

以上兩種適配體由上海生物工程公司合成

1.1.3主要試劑和儀器 RMPI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；PBS緩沖液購(gòu)自上?；鄯f生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、PMSF、蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自上海碧云天公司；酵母tRNA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、BSA購(gòu)自上海生物工程公司；洗滌緩沖液(washing buffer，WB)、結(jié)合緩沖液(binding buffer，BB)以及DNA封閉液由實(shí)驗(yàn)室自行配置； WB：含有4.5 g/L葡萄糖及5 mmol/L MgCl2的DPBS；BB：含有1 mg/ml BSA和0.1 mg/ml酵母tRNA的WB；DNA封閉液：5 mg鮭魚(yú)精DNA和1 ml胎牛血清加入4 ml的BB；鏈霉親和素包被的瓊脂糖凝膠珠、Q Exactive Plus質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；Guava easyCyte 5流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司；CLM-170B-8-NF型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海Esco公司。

1.2 方法

1.2.1LW-25靶標(biāo)類(lèi)型的鑒定 核酸適配體的靶標(biāo)類(lèi)型通過(guò)胰蛋白酶消化細(xì)胞蛋白，然后將細(xì)胞與核酸適配體孵育，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其結(jié)合結(jié)果來(lái)確定。

1.2.2SC細(xì)胞的培養(yǎng) 將HGC-27細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3收集蛋白樣品 收集2×108的HGC27細(xì)胞；洗滌消化后收集在離心管中，將細(xì)胞加入含有PBS(pH 7.4)、2%Triton-X-100(V/V)、0.4%SDS(W/V)、5 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF以及蛋白酶抑制劑混合物的裂解液，于4 ℃、水平搖床上孵育裂解50 min，將細(xì)胞裂解液在4 ℃、6 500 r/min離心5 min，保留上清液作為蛋白質(zhì)樣品。

1.2.4蛋白上樣樣品的制備 通過(guò)適配體下拉實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將適配體LW-25和文庫(kù)分別與蛋白質(zhì)樣品孵育，進(jìn)而分別與鏈霉親和素包被的瓊脂糖凝膠珠孵育，利用鏈酶親和素和生物素的相互作用，通過(guò)高溫變性洗脫LW-25和文庫(kù)結(jié)合的蛋白質(zhì)。

具體而言，分別取90 μl瓊脂糖凝膠珠置于3個(gè)EP管中并用WB洗滌3次；用5%的BSA封閉珠子1 h，封閉完成后用WB洗滌珠子5次。收集的蛋白質(zhì)樣品加入DNA封閉液孵育1 h，封閉完取100 μl留作全蛋白樣品組。將封閉后的蛋白質(zhì)樣品與400 nmol/L的LW-25在4 ℃水平搖床上孵育1 h，離心后的上清液與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集已經(jīng)捕獲蛋白質(zhì)-LW-25復(fù)合物的瓊脂糖凝膠珠；將封閉后的蛋白質(zhì)樣品與400 nmol/L的Lib在4 ℃搖床上孵育1 h，離心后的上清液繼續(xù)與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集已經(jīng)捕獲蛋白質(zhì)-Lib復(fù)合物的瓊脂糖凝膠珠；將封閉的蛋白質(zhì)樣品直接與0.9 mg(90 μl)瓊脂糖凝膠珠在4 ℃振蕩器上孵育1 h，用磁鐵收集瓊脂糖凝膠珠；收集的珠子用WB洗滌5次。

1.2.5SDS-PAGE 向3組珠子中各加入30 μl 1×上樣緩沖液，向預(yù)留的100 μl全蛋白中加入25 μl 5×上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。將變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳后，將其浸入考馬斯亮藍(lán)染液中35 min，染色后用超純水脫色，直至條帶清晰可見(jiàn)。用凝膠成像儀掃描SDS-PAGE凝膠以獲得圖像，并分析圖像結(jié)果找出差異條帶。

1.2.6質(zhì)譜檢測(cè)差異條帶 切下SDS-PAGE凝膠中的差異條帶并送質(zhì)譜檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 LW-25靶標(biāo)類(lèi)型分析先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，再將消化后的細(xì)胞與適配體孵育。未經(jīng)胰酶處理的細(xì)胞與適配體有著很強(qiáng)的結(jié)合力，而經(jīng)胰酶處理的細(xì)胞與適配體結(jié)合強(qiáng)度明顯下降,說(shuō)明核酸適配體LW-25的靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。見(jiàn)圖1。

圖1 LW-25的靶標(biāo)類(lèi)型圖

2.2 SDS-PAGE成功檢測(cè)到差異條帶在用凝膠電泳掃描儀掃描后，獲得掃描圖，找到差異條帶，即箭頭所指蛋白條帶，差異條帶處可見(jiàn)LW-25組蛋白表達(dá)量要明顯高于文庫(kù)對(duì)照組?？瞻字樽咏M在相應(yīng)位置則無(wú)明顯條帶。見(jiàn)圖2。

圖2 考馬斯亮藍(lán)染色的10%SDS-PAGE 凝膠圖

1：Marker；2：全蛋白；3：空白珠子樣；4：文庫(kù)珠子樣；5：核酸適配體LW-25珠子樣

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析出最明顯的差異蛋白將切下的差異條帶送去質(zhì)譜檢測(cè)，獲得差異條帶中的蛋白信息見(jiàn)圖3。圖中可見(jiàn)不含POU結(jié)構(gòu)域的八聚核苷酸結(jié)合蛋白(non-POU domain-containing octamer-binding protein,NONO)在適配體LW-25樣品組中量極高，在文庫(kù)對(duì)照組中蛋白量很少，在空白珠子對(duì)照組中幾乎沒(méi)有，并且NONO(54.2 ku)的大小與從SDS-PAGE凝膠上切下條帶的分子量正好相關(guān)。

圖3 差異蛋白條帶質(zhì)譜分析結(jié)果

A：LW-25結(jié)合的蛋白質(zhì)；B：文庫(kù)結(jié)合的蛋白質(zhì)；C：空白珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)；D：NONO的肽指紋圖譜

3 討論

SC是種致命的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移與侵襲是患者死亡的主要原因。大約有50%患者在SC確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[3]。因此，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤并預(yù)防其轉(zhuǎn)移顯得十分重要。特異性指示SC轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)志物的鑒定，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)SC的早期檢測(cè)，還可以深入了解SC的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)SC的預(yù)防和治療。

尋找腫瘤標(biāo)志物一直是醫(yī)師和生物研究人員熱衷的研究方向，如原發(fā)性肝癌患者血清中的甲胎蛋白被公認(rèn)為是肝癌最具診斷價(jià)值的診斷指標(biāo)[4]。然而像甲胎蛋白這種具有重要診斷價(jià)值并投入臨床實(shí)踐的標(biāo)志物卻很少，這種現(xiàn)象可以歸因于兩個(gè)主要方面：① 缺乏用于腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的有效方法；② 缺乏用于腫瘤標(biāo)志物驗(yàn)證和應(yīng)用的實(shí)際測(cè)定的分子工具。

核酸適配體具有無(wú)免疫原性、尺寸小、優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性以及容易生產(chǎn)的特性，能夠通過(guò)折疊三維結(jié)構(gòu)以高親和力與靶標(biāo)特異性結(jié)合，并且能在分子水平上區(qū)分惡性腫瘤細(xì)胞及其相應(yīng)的正常細(xì)胞，在識(shí)別分子差異上具有很大優(yōu)勢(shì)[5]。因此，可以把適配體用作探索腫瘤標(biāo)志物的理想分子探針，進(jìn)而通過(guò)后期的質(zhì)譜檢測(cè)分析出核酸適配體所結(jié)合的靶標(biāo)。此外利用細(xì)胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選的適配體可以繼續(xù)用于鑒定腫瘤新的標(biāo)志物[6]。到目前為止，利用細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選出來(lái)的適配體已經(jīng)鑒定出了多種腫瘤標(biāo)志物，如酪氨酸蛋白激酶7[7]、免疫球蛋白重μ鏈[8]、應(yīng)激誘導(dǎo)磷蛋白1[9]等。

尋找核酸適配體靶蛋白實(shí)驗(yàn)已存在許多年，但利用此種方法找到的腫瘤標(biāo)志物卻很少，說(shuō)明此種方法還存在一些難點(diǎn)有待解決。比如靶蛋白分子量不清楚因而很難鎖定電泳中的靶標(biāo)所在的條帶。從捕獲蛋白-適配體的磁珠洗去非特異性蛋白時(shí)需要適當(dāng)?shù)南礈鞐l件，過(guò)度的洗滌有可能將靶蛋白一同洗掉，洗滌不足會(huì)存留大量的非特異性蛋白，導(dǎo)致質(zhì)譜結(jié)果數(shù)據(jù)繁多復(fù)雜，很難判斷哪個(gè)是靶蛋白。本實(shí)驗(yàn)中一些技術(shù)環(huán)節(jié)上的改進(jìn)，如多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確保結(jié)果的可靠性；通過(guò)加大細(xì)胞量去避免靶標(biāo)蛋白因濃度過(guò)低導(dǎo)致SDS-PAGE檢測(cè)不出條帶的問(wèn)題；在核酸適配體和蛋白孵育時(shí)通過(guò)加大鹽濃度以促進(jìn)適配體和靶蛋白的牢固結(jié)合，并通過(guò)嚴(yán)格的洗滌步驟以去除非特異性結(jié)合蛋白等。這使得在重復(fù)SDS-PAGE時(shí)可以穩(wěn)定的得到相同的差異條帶。

本研究顯示NONO參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展, 有文獻(xiàn)[10]報(bào)道稱(chēng)在乳腺癌細(xì)胞系SKBR3 (HER2/c-erb-2過(guò)表達(dá)) 中敲除P54nrb/NONO可抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移, 提示p54nrb/NONO很可能是促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的重要調(diào)控蛋白；同時(shí)許多的研究表明NONO也能促進(jìn)黑色素瘤[11]、膀胱移行細(xì)胞癌[12]、鼻咽癌[13]的侵襲和轉(zhuǎn)移。這與適配體LW-25可以特異性識(shí)別SC轉(zhuǎn)移細(xì)胞的特性很好的吻合，綜合以上結(jié)果推斷NONO極有可能是LW-25的靶標(biāo)蛋白，并很可能也是引起SC轉(zhuǎn)移的重要蛋白, 但其作用機(jī)制仍不清楚。相信NONO基因功能的深入研究將為臨床預(yù)測(cè)癌癥轉(zhuǎn)移和治療癌癥帶來(lái)巨大潛力。