讓 凌，謝曉芳，冉 然，薛 銳，肖 昀，鄭 飛，唐俊明

神經(jīng)痛在臨床上很常見(jiàn)，如糖尿病性神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛等，因發(fā)生機(jī)制尚不清楚，尚缺乏有效的治療手段[1]。神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性升高是神經(jīng)痛的重要發(fā)生機(jī)制[2-3]。γ-氨基丁酸(γ-aninobutyrate，GABA)重?cái)z取是釋放入突觸內(nèi)的GABA作用被終止的主要方式，其通過(guò)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GABA transporter，GAT)將釋放入突觸內(nèi)的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)入神經(jīng)元胞體或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，從而終止GABA的作用，改變神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[4]。研究[5]已經(jīng)證實(shí)，背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)內(nèi)有GAT3的表達(dá)，但神經(jīng)損傷后GAT3是否發(fā)生改變，這些改變是否和神經(jīng)痛的發(fā)生有關(guān)，目前還沒(méi)有研究涉及。該研究探討了大鼠坐骨神經(jīng)慢性束縛損傷(chronic constriction injury，CCI)模型上GAT3的改變，并且運(yùn)用DRG局部注射技術(shù)，將GAT3抑制劑注射在DRG局部，探討其對(duì)神經(jīng)痛癥狀的影響，旨在為神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制和治療尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年雄性SD大鼠36只，SPF級(jí)，體質(zhì)量170～220 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)室溫為(22±2)℃，濕度40%～70%，12 h晝夜交替，自由進(jìn)食水。所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，按照國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2 CCI模型參照以往文獻(xiàn)[6-7]，動(dòng)物水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射后在右大腿中部切開(kāi)皮膚，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)干，于坐骨神經(jīng)分支近端處用4/0#羊腸線在坐骨神經(jīng)上間隔1 mm做4個(gè)松結(jié)扎，結(jié)扎強(qiáng)度以大腿產(chǎn)生1個(gè)小的短暫性抽搐為宜，然后逐層縫合。術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng)，12 h明暗交替光照，行為學(xué)測(cè)定確定神經(jīng)痛造模成功。

1.3 Western blot動(dòng)物用水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中保存，經(jīng)RIPA裂解液(武漢Antgene公司)裂解，離心收集蛋白，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。每個(gè)加樣孔30 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳后, 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用TBS配制的5%脫脂奶粉低速搖床封閉1 h。4 ℃下一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶顯色劑顯色，Bio Rad蛋白成像儀成像, 用Image J軟件測(cè)灰度值進(jìn)行半定量分析。所使用的抗體包括： α-Tubulin(小鼠抗大鼠，抗體稀釋比1 ∶1 000,美國(guó)Sigma公司)、GAT3一抗(兔抗大鼠，抗體稀釋比1 ∶750，美國(guó)Abcam公司)；GAT3二抗(山羊抗兔，抗體稀釋比1 ∶10 000)、內(nèi)參二抗(山羊抗小鼠，抗體稀釋比1 ∶10 000，美國(guó)Jackson公司)。

1.4 RT-PCR動(dòng)物用水合氯醛(30～40 mg/kg，ip)麻醉后，冰上快速取出L4、L5DRG，置于液氮中研磨， TRIzol法提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，行分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR PremixEx Ⅱ法行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)GAT3的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參，使用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的差異倍數(shù)。

表1 引物序列

1.5 L5DRG局部置管參照文獻(xiàn)[8]方法，動(dòng)物經(jīng)水合氯醛(30～40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在大鼠背部L4-L6右側(cè)旁開(kāi)0.5 cm處，切開(kāi)背部皮膚，鈍性分離皮下組織和椎旁肌肉，暴露L5椎板，在椎間孔內(nèi)2 mm處鉆1個(gè)0.8 mm的孔，將預(yù)制的套管插入孔內(nèi)2 mm，骨水泥固定，連接PE 10聚丙烯管，切口縫合。術(shù)后將大鼠分別安置在裝有木屑地板的塑料籠子中，自由攝食和飲水，每次實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境至少24 h。

1.6 大鼠后爪熱痛閾測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]方法，用大鼠爪痛覺(jué)檢測(cè)儀(意大利UGO公司)測(cè)定大鼠后爪熱痛閾。將大鼠放在玻璃籠器內(nèi)，待大鼠適應(yīng)安靜后，將光源對(duì)準(zhǔn)大鼠后足掌心，打開(kāi)光源開(kāi)關(guān)并自動(dòng)開(kāi)始計(jì)時(shí)，直到大鼠因疼痛出現(xiàn)縮足反射，計(jì)時(shí)結(jié)束，此時(shí)記錄的時(shí)間為后爪熱痛縮退反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal lantency, PWL)。為防止皮膚灼傷，設(shè)置最大強(qiáng)度55%，保護(hù)時(shí)間為25 s。測(cè)量5次，每次間隔10 min，取均值，即為大鼠熱痛閾值。

2 結(jié)果

2.1 CCI對(duì)大鼠痛閾的影響SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組，n=6)和CCI組(n=6)，CCI組動(dòng)物實(shí)施坐骨神經(jīng)結(jié)扎，Sham組動(dòng)物暴露坐骨神經(jīng)，但不做結(jié)扎；與Sham組比較，術(shù)后第1天開(kāi)始，CCI組大鼠PWL出現(xiàn)顯著降低(F=57.296,P<0.05)，這個(gè)改變持續(xù)到術(shù)后7 d。見(jiàn)圖1。

圖1 CCI對(duì)大鼠痛閾的影響與Sham組比較：*P<0.05

2.2 CCI對(duì)大鼠DRG內(nèi)GAT3蛋白和mRNA表達(dá)的影響與Sham組比較，CCI組DRG 內(nèi)GAT3蛋白在術(shù)后第3天有所增加(t=3.719,P<0.05)，見(jiàn)圖2。與Sham組比較，CCI術(shù)后DRG內(nèi)GAT3 mRNA表達(dá)明顯增加(t=5.369,P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 CCI術(shù)后第3天DRG內(nèi)GAT3的表達(dá)變化與Sham組比較：*P<0.05

圖3 DRG內(nèi)GAT3 mRNA表達(dá)變化與Sham組比較：*P<0.05

2.3 L5DRG局部注射GAT3抑制劑SNAP5114對(duì)大鼠痛閾的影響SD大鼠12只，預(yù)先置入導(dǎo)管并實(shí)施CCI手術(shù)，隨機(jī)分為CCI組(n=6)和SNAP5114治療組(SNAP組，n=6)，在第3天分別通過(guò)導(dǎo)管給CCI組大鼠注射溶劑DMSO(10 μl)，給SNAP組大鼠GAT3抑制劑[(S)-1-[2-[三(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-3-哌啶甲酸((S)-1-[2-[tris(4-methoxyphenyl)methoxy] ethyl]-3-piperidinecarboxylic acid，SNAP5114)(200 μg, 10 μl)，分別于注射前、注射后30、60、120 min、24 h、48 h測(cè)雙側(cè)后爪熱痛閾值PWL，對(duì)比雙側(cè)后爪PWL。CCI組注射DMSO后大鼠后爪痛閾值沒(méi)有明顯改變(P>0.05)。與CCI組(0.369±0.151)比較，SNAP組(0.779±0.095)DRG局部注射SNAP5114 120 min后，患側(cè)后爪熱痛閾值明顯上升(F=10.822,P<0.05)，持續(xù)至注射后24 h[CCI組：(0.616±0.0501)，SNAP組：(0.859±0.017)；F=42.939，P<0.05]。見(jiàn)圖4。DRG局部注射SNAP5114后120 min，患側(cè)后爪熱痛閾值明顯上升，持續(xù)至注射后24 h；箭頭表示注射時(shí)間。

圖4 L5 DRG局部注射GAT3抑制劑SNAP5114對(duì)大鼠痛閾的影響與CCI組比較：*P<0.05

3 討論

本研究采用CCI神經(jīng)痛模型，CCI 損傷后大鼠表現(xiàn)為自發(fā)痛(自發(fā)抬起損傷肢體，時(shí)而舔足、咬足或甩足，避免損傷側(cè)的負(fù)重)、痛覺(jué)過(guò)敏(機(jī)械痛敏和熱痛敏)[6-9]。本研究中，與Sham組比較，CCI模型組的大鼠在術(shù)后1 d熱痛閾值明顯下降，表現(xiàn)為熱痛敏，并持續(xù)到術(shù)后7 d，說(shuō)明造模成功。

因?yàn)橥挥|間隙中GABA不能被酶分解，所以突觸中GABA清除需要GAT的再攝取[10-11]，GAT位于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的質(zhì)膜上，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞外GABA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與疼痛有關(guān)的主要有GAT1和GAT3[10]。先前研究[12]顯示用角叉菜膠注射誘發(fā)神經(jīng)痛后，三叉神經(jīng)脊束核的三叉神經(jīng)元GAT3表達(dá)增加，并認(rèn)為這種GAT3表達(dá)增加減少了脊髓三叉神經(jīng)元突觸內(nèi)GABA的作用時(shí)間，導(dǎo)致GABA作用的減弱，從而引起神經(jīng)系統(tǒng)致敏。但也有研究[5]報(bào)道神經(jīng)痛動(dòng)物GAT3表達(dá)下降，在紫杉醇誘發(fā)的神經(jīng)痛模型中，脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞中GAT3的表達(dá)是減少的。還有研究[13-15]表明，GAT3在病理狀態(tài)下后功能發(fā)生改變，出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)了GABA從神經(jīng)突觸末梢向突觸內(nèi)的逆向釋放，這種逆向釋放代償了神經(jīng)損傷后GABA作用的減弱，因此GAT3表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)痛的發(fā)生?？傊?，神經(jīng)痛動(dòng)物中GAT3的改變還存在爭(zhēng)議。而本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，術(shù)后第3天DRG內(nèi)GAT3蛋白以及GAT3 mRNA均有所增加，進(jìn)一步在DRG局部使用GAT3抑制劑后，CCI大鼠的痛閾值明顯升高，出現(xiàn)神經(jīng)痛的癥狀的緩解。這可能是神經(jīng)損傷后GAT3的表達(dá)增加加速了神經(jīng)突觸中GABA清除，從而使突觸中GABA濃度降低，作用時(shí)間縮短，GABA能抑制信號(hào)減弱，導(dǎo)致機(jī)體痛覺(jué)過(guò)敏，是神經(jīng)痛的發(fā)生機(jī)制。本研究只探討了GAT3量的改變，GAT3的功能是否在神經(jīng)損傷后發(fā)生改變需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

為特異性的研究L5DRG局部GAT3在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用，術(shù)前給予大鼠L5DRG局部置管，排除管子脫落、麻醉等因素影響，在術(shù)后第3天通過(guò)導(dǎo)管將GAT3抑制劑SNAP5114局部注射在DRG附近，減少了SNAP5114吸收入血或入腦脊液產(chǎn)生副作用。結(jié)果表明，注射后24 h大鼠的疼痛有所緩解，提示抑制GAT3對(duì)大鼠神經(jīng)病理痛有一定的鎮(zhèn)痛作用。但連續(xù)測(cè)定顯示，疼痛緩解的持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，注射后48 h和對(duì)照組痛閾無(wú)明顯差異，說(shuō)明L5DRG內(nèi)GAT3表達(dá)的升高可能并非神經(jīng)痛發(fā)病的主要因素，GAT3升高可能是神經(jīng)痛其他原發(fā)病因?qū)е碌慕Y(jié)果，需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，神經(jīng)損傷后DRG內(nèi)GAT3表達(dá)明顯升高，DRG局部給予GAT3抑制劑可短暫緩解神經(jīng)痛的癥狀，L5DRG內(nèi)GAT3表達(dá)升高并非神經(jīng)痛發(fā)病的主要因素。