江源銘，盛寶英

miRNA是一種單鏈RNA，其不能編碼蛋白質(zhì)，miR-141-3p編碼基因位于14號染色體上，屬于miR-200家族，參與腫瘤的發(fā)生，其在不同腫瘤組織中的表達水平不同，目前在膠質(zhì)瘤、胰腺癌、食管癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-141-3p低表達，而在乳腺癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-141-3p高表達[1-3]。miR-141-3p參與調(diào)控腫瘤細胞的生長，其對于不同的腫瘤細胞作用不同，miR-141-3p可以抑制食管癌等腫瘤細胞的惡性表型[4]。Wnt通路在膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中過度激活，抑制其激活可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞惡性增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。該實驗探討miR-141-3p在腦膠質(zhì)瘤細胞生長凋亡中的作用及機制，為明確miR-141-3p在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料正常星形膠質(zhì)細胞HA購自上?；馍锟萍加邢薰荆荒X膠質(zhì)瘤細胞CHG-5、U-87MG、U251購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫；mimics control、miR-141-3p mimics購自南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Lipotectamine2000購自美國 Invitrogen公司；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體、c-myc抗體、生存蛋白(survivin)抗體和活化型Caspase-3(C-caspase-3)抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 Real-time PCR檢測miR-141-3p在膠質(zhì)瘤細胞中的表達取正常星形膠質(zhì)細胞HA和腦膠質(zhì)瘤細胞CHG-5、U-87MG、U251，按照每個25 mm的培養(yǎng)瓶中加入1 ml的TRIzol，置于冰上裂解，期間用移液槍反復(fù)吹打，把裂解液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，添加200 μl的氯仿，在室溫下孵育3 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。RNA存在上層水相溶液中，收集500 μl上層RNA溶液，加入等體積異丙醇，于4 ℃環(huán)境中孵育30 min。離心后，將上清液吸除，添加75%的乙醇洗滌沉淀，干燥后，以DEPC水溶解。取提取的RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行Real-time PCR，程序為：95 ℃、15 min；95 ℃變性15 s；54 ℃、60s；共50個循環(huán)。以2-ΔΔCt法分析miR-141-3p水平，內(nèi)參為U6。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和過表達效果檢測取U-87MG細胞，接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，按照Lipotectamine 2000說明書將mimics control、miR-141-3p mimics轉(zhuǎn)染至細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，提取細胞中的總RNA，進行Real-time PCR，步驟同上。設(shè)置轉(zhuǎn)染mimics control、miR-141-3p mimics后的U-87MG細胞為mimics control組、miR-141-3p mimics組，以只加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipotectamine2000的U-87MG細胞為Control組。

1.4 MTT檢測細胞增殖按照細胞量為5×104個/ml將Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞接種到96孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以后，將培養(yǎng)板取出，在每個孔內(nèi)加入0.5%的MTT溶液，孵育4 h以后，吸棄孔內(nèi)液體，添加DMSO溶液150μl，結(jié)晶溶解以后，檢測490 nm的吸光度(A)值，經(jīng)過空白孔調(diào)零以后，分析細胞存活率變化，以Control組細胞存活率為100%，分析mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞存活率變化。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力將Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞分別接種到6孔板內(nèi)，每個孔中添加3 000個細胞，同時加入2 ml的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育培養(yǎng)14 d以后，吸棄孔內(nèi)的上清液，PBS洗滌細胞后添加甲醇溶液固定15 min，用蘇木精染色，隨機選取5個視野檢測細胞克隆形成數(shù)目。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡將培養(yǎng)24 h后的Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞用PBS洗滌3次以后，每組收集106個細胞，添加500 μl的Binding Buffer混合后，分別加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)溶液，混合后，用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡變化。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.7 Western blot檢測β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達將培養(yǎng)24 h后的Control組、mimics control組、miR-141-3p mimics組細胞用PBS洗滌3次以后，收集細胞，在細胞內(nèi)加裂解液(按照每個6孔板中添加100 μl裂解液)，在冰上裂解約30 min。收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，分裝后，保存于-80 ℃。吸取2 μl的蛋白樣品以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度。蛋白樣品同上樣緩沖液混勻，于100 ℃煮沸10 min后，每個上樣孔加30 μg蛋白樣品進行電泳。制膠：常規(guī)方法配制10%分離膠，觀察其凝固以后，添加5%的濃縮膠。蛋白電泳的起始電壓為60 V，觀察溴酚藍進入到分離膠后，將電壓調(diào)整到100 V繼續(xù)電泳。轉(zhuǎn)膜：以300 mA電流把凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，轉(zhuǎn)膜置于冰上進行，時間為1.5 h。封閉：用5%牛血清白蛋白于37 ℃搖床封閉約2 h。把NC膜放在含有1 ∶600稀釋的一抗的薄膜抗體孵育袋中，置于4 ℃中過夜。把NC膜放在含有1 ∶3 000稀釋的二抗的抗體孵育袋中，于37 ℃孵育2 h。將NC膜置于ECL試劑中發(fā)光，收集圖像，以β-actin為參照，分析β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p在膠質(zhì)瘤細胞中低表達腦膠質(zhì)瘤細胞CHG-5(0.68±0.06)、U-87MG(0.27±0.03)、U251(0.49±0.09)中的miR-141-3p表達水平低于正常星形膠質(zhì)細胞HA(1.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=91.111，P<0.001)。并且U-87MG細胞中miR-141-3p表達水平低于CHG-5和U251細胞。選用U-87MG細胞做后續(xù)實驗。

2.2 miR-141-3p mimics提高U-87MG細胞中miR-141-3p表達水平miR-141-3p mimics轉(zhuǎn)染后的U-87MG細胞中miR-141-3表達水平高于沒有轉(zhuǎn)染(1.00)及轉(zhuǎn)染mimics control(0.99±0.09)的細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.604，P<0.001)。

2.3 miR-141-3p抑制U-87MG細胞增殖、克隆并促進細胞凋亡miR-141-3p過表達后的U-87MG細胞增殖和克隆形成能力降低，細胞凋亡率升高，與沒有轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染mimics control的細胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、圖1。

2.4 過表達miR-141-3p對U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達水平影響miR-141-3p過表達后的U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin蛋白表達水平降低，C-caspase-3 蛋白表達水平升高，與沒有轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染mimics control組的細胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2、表2。

表1 各組U-87MG細胞存活率、克隆形成數(shù)目和凋亡率比較

與mimics control組比較：*P<0.05

圖1 流式細胞術(shù)測定miR-141-3p對U-87MG細胞凋亡影響表2 各組U-87MG細胞中β-catenin、c-myc、survivin和C-caspase-3蛋白表達水平比較

項目Control組mimics control組miR-141-3p mimics組F值P值β-catenin0.89±0.060.90±0.070.45±0.05?54.027<0.001survivin0.63±0.060.60±0.080.58±0.07?20.4520.002c-myc0.60±0.050.58±0.070.42±0.03?10.5540.011C-caspase-30.43±0.040.40±0.060.68±0.04?31.2790.001

與mimics control組比較：*P<0.05

圖2 Western blot分析各組細胞中β-catenin、c-myc、 survivin和C-caspase-3蛋白表達影響1：Control組；2：mimics control組；3：miR-141-3p mimics組

3 討論

miRNA長度約為15～25 bp，其在人體組織中廣泛表達，胚胎發(fā)育、組織功能維持等生理過程中幾乎均有miRNA的參與，miRNA還參與調(diào)控心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤等病理過程[6]。miR-141-3p是一種與細胞生長凋亡等密切相關(guān)的調(diào)控因子，參與調(diào)控神經(jīng)細胞等多種細胞的正常生理功能發(fā)揮[7]。miR-141-3p在腫瘤組織中異常表達，其可以作為腫瘤促進因子或腫瘤抑制因子發(fā)揮腫瘤細胞生長調(diào)控作用，目前在乳腺癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-141-3p過表達，也有研究顯示miR-141-3p在乳腺癌及食管癌組織中低表達，miR-141-3p可能是一種腫瘤抑制因子[8-12]。本實驗結(jié)果顯示，miR-141-3p在膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平低于正常星形膠質(zhì)細胞，提示miR-141-3p在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮抗腫瘤作用。

miRNA參與腫瘤發(fā)生過程往往與腫瘤細胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)，目前的研究表明，miR-141-3p對于腫瘤細胞的生長、凋亡等具有重要作用，miR-141-3p能夠抑制胃癌等腫瘤細胞的生長，而miR-141-3p對于前列腺癌等腫瘤細胞的生長具有促進作用[13]。本次實驗研究顯示，miR-141-3p過表達后的膠質(zhì)瘤細胞的增殖和克隆形成能力降低，細胞凋亡增多，細胞中凋亡標(biāo)志蛋白Caspase-3活化水平升高，miR-141-3p在膠質(zhì)瘤生長中發(fā)揮抑制作用。

Wnt信號通路能夠把細胞表面的信號傳遞至細胞內(nèi)，其是由β-catenin、c-myc、survivin等組成，其中β-catenin是Wnt信號通路激活的關(guān)鍵，β-catenin也是Wnt信號通路的中心，β-catenin表達水平的高低可以間接反映Wnt信號通路的激活水平；survivin是一個凋亡抑制基因，其具有抑制細胞凋亡的作用，Wnt信號通路激活可以促進survivin表達；c-myc是Wnt信號通路的下游靶基因，也是一種癌基因[14]。很多研究[15]顯示，Wnt信號通路在腫瘤中過度激活，抑制其激活可以抑制腫瘤發(fā)生和進展。本研究顯示，miR-141-3p過表達可以下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中β-catenin、c-myc、survivin的表達水平，miR-141-3p能夠負(fù)調(diào)控Wnt信號，miR-141-3p抑制膠質(zhì)瘤生長機制可能與Wnt信號通路有關(guān)。