王惠國(guó)，蔡 珂，，韓鑫龍，，李雨桐，，袁立霞，譚曉梅,4，湯慶發(fā),4，邢學(xué)鋒,4，陳飛龍,4，吳長(zhǎng)清，唐 玲,4

肝癌細(xì)胞(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，占原發(fā)性肝癌的90%[1]。盡管新型治療法和診斷技術(shù)取得了巨大的成就，但早期發(fā)現(xiàn)HCC很困難，導(dǎo)致HCC患者5年生存率較低(0～14%)[1]。因此，發(fā)現(xiàn)能夠鑒定HCC的特異和敏感的生物標(biāo)志至關(guān)重要。青蒿是一種重要的中草藥植物，從青蒿草本植物中提取的青蒿素是抗瘧疾藥物的有效成分。近年來，已報(bào)道了青蒿素的其他功能[2]。最近青蒿素作為抗癌劑由其臨床安全性和廣泛的功效而受到廣泛關(guān)注。

在肝細(xì)胞癌中，miRNA經(jīng)常呈現(xiàn)異常的表達(dá)譜，這使得其對(duì)于診斷或預(yù)后應(yīng)用具有潛在的吸引力。該研究通過RNA-Seq技術(shù)，分析在青蒿素藥物作用下，肝癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)與調(diào)控肝癌增殖有關(guān)的miRNA，為青蒿素在肝癌治療策略發(fā)展中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物 青蒿素購自美國(guó)Sigma公司(規(guī)格：361593-100 MG)；在二甲基亞砜(DMSO)中制備青蒿素的儲(chǔ)備溶液； DMSO的最終濃度保持低于0.01%。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑與器材 DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司；RNAiso plus、Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)均購自日本TaKaRa公司；AMOAF1000自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7，在含有10% FBS和1%青霉素、1%鏈霉素的培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞狀態(tài)良好并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，每組重復(fù)6個(gè)孔。

1.2.2Cell Viability Assay法測(cè)定細(xì)胞增殖 以每孔3 000個(gè)細(xì)胞，將HepG2和Huh7細(xì)胞接種到96孔板，加入完全培養(yǎng)基中并使其附著過夜。第2天加入青蒿素(0、50、100、150、200 μmol/L)處理24、48 h。每個(gè)孔中加入20 μl CellTiter-Blue?Luminescent Cell Viability Assay。使用Bio-Rad細(xì)胞成像檢測(cè)儀測(cè)量Luminescent的吸光度值。

1.2.3結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖 將HepG2和Huh7細(xì)胞接種到12孔板，加入完全培養(yǎng)基中并使其附著過夜(每孔2 000個(gè)細(xì)胞)。第2天加入青蒿素(0、100 μmol/L)處理7 d。用PBS清洗2遍，每孔加入500 μl的結(jié)晶紫溶液，搖床孵育30 min后，PBS清洗3次，每孔加入10%冰醋酸溶液1 ml，搖床孵育10 min后，每孔取等量的溶液入96孔板中，測(cè)取550 nm吸光度值。

4.5 通過試驗(yàn)篩選出高效低毒低殘留的農(nóng)藥 使用化學(xué)農(nóng)藥上要疏堵結(jié)合，疏就要給煙農(nóng)提供可使用的化學(xué)農(nóng)藥。通過開展試驗(yàn)篩選出適用于煙葉病蟲害防治的高效低毒低殘留的農(nóng)藥品種，煙草公司統(tǒng)一采購、統(tǒng)一管理，煙農(nóng)可以在煙草公司選購到合適的防治農(nóng)藥品種，避免煙農(nóng)在市場(chǎng)上盲目購買高毒高殘留農(nóng)藥，而且有利于管理，對(duì)形成以“技術(shù)、信息、咨詢、物資供應(yīng)”等一條龍服務(wù)打下基礎(chǔ)。堵就是要禁止煙農(nóng)使用高毒、高殘留、易超限的農(nóng)藥品種，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)使用者將影響其煙葉被收購等級(jí)和來年種植合同簽訂面積。

1.2.4肝癌細(xì)胞總RNA提取、文庫構(gòu)建與測(cè)序 收集藥物處理24 h的肝癌細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)行消化處理，離心后棄上清液加入PBS清洗2遍后，加入1 ml的RNAiso Plus，室溫靜置5 min，加入200 μl氯仿并振蕩混勻，室溫靜置5 min，離心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中且加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，離心10 min(10 360 r/min、4 ℃)。棄上清液，加入1 ml的75%乙醇清洗沉淀，離心5 min(10 360 r/min，4 ℃)。收集沉淀，并自然干燥，溶解于適量的DEPC處理水中。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，在得到的mRNA中合成cDNA，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5novel miRNA的預(yù)測(cè) miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能夠用來預(yù)測(cè)新的miRNA。整合miREvo和mirdeep 2這些miRNA預(yù)測(cè)軟件來進(jìn)行新miRNA的分析，基本原理是通過截取一定長(zhǎng)度sRNA比對(duì)上的參考序列，通過探尋其二級(jí)結(jié)構(gòu)及Dicer酶切位點(diǎn)信息、能量等特征進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)樣品中novel miRNA，并進(jìn)行各樣本中匹配上的sRNA的序列、長(zhǎng)度、出現(xiàn)的次數(shù)等信息，以及不同長(zhǎng)度miRNA的首位點(diǎn)堿基分布和所有miRNA的各位點(diǎn)堿基分布情況的統(tǒng)計(jì)。

1.2.6差異表達(dá)miRNA和靶基因的鑒定 對(duì)各樣本中已知和新miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，并用DEGseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，在獲得差異表達(dá)的miRNA中挑選顯著性高表達(dá)和低表達(dá)的miRNA，用miRanda、PITA和RNAhybrid三個(gè)軟件的交集預(yù)測(cè)miRNA靶基因。由于每個(gè)miRNA鑒定到的靶基因較多，只挑選分值小于-1.2，且能量值小于7的。用火山圖可以推斷差異miRNA的整體分布情況，從差異倍數(shù)(fold change)和校正后的顯著水平(padj/qvalue)兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估，對(duì)差異miRNA進(jìn)行篩選。橫坐標(biāo)代表miRNA在不同實(shí)驗(yàn)組中/不同樣品中表達(dá)倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表miRNA表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著程度，圖中的散點(diǎn)代表各個(gè)miRNA，藍(lán)色圓點(diǎn)表示無顯著性差異的miRNA，紅色圓點(diǎn)表示顯著上調(diào)的差異miRNA，綠色圓點(diǎn)表示顯著下調(diào)的差異miRNA。

1.2.7差異miRNA靶基因富集分析 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集程度通過Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因個(gè)數(shù)來衡量。其中Rich factor指差異表達(dá)的基因中位于該pathway條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數(shù)的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的Pvalue，Qvalue的取值范圍為(0，1)，越接近于零，表示富集越顯著。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7增殖的抑制作用Cell Viability實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿素對(duì)HepG2、Huh7兩種肝癌細(xì)胞有增殖抑制作用且呈現(xiàn)量效、時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且青蒿素濃度100 μmol/L在24 h時(shí)就具有明顯的抑制效果，見表1、2。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度100 μmol/L青蒿素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率為(21.93±6.90)%，對(duì)Huh7的抑制率為(52.59±3.63)%，有明顯的抑制效果且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇青蒿素藥物濃度100 μmol/L，藥物作用時(shí)間24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表1 青蒿素對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用的抑制率

與青蒿素組0 μmol/L比較：*P<0.05；與24 h作用時(shí)間點(diǎn)比較：#P<0.05

表2 青蒿素對(duì)人肝癌細(xì)胞Huh7增殖作用的抑制率

與青蒿素組0 μmol/L比較：*P<0.05；與24 h作用時(shí)間點(diǎn)比較：#P<0.05

圖1 青蒿素對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響與對(duì)照組比較：**P<0.01，****P<0.000 1

2.2 microRNAs 二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

2.2.1Noverl miRNA預(yù)測(cè) 在HepG2和Huh7兩種肝癌細(xì)胞中，加入100 μmol/L濃度的青蒿素，作用24 h，其細(xì)胞內(nèi)的miRNA與對(duì)照組相比，整合miREvo和mirdeep2這些miRNA預(yù)測(cè)軟件來進(jìn)行新miRNA的分析，分析得到10種新的miRNA。在二級(jí)結(jié)構(gòu)示意中，整個(gè)序列是miRNA前體，紅色突出部分為Noverl miRNA的成熟體序列。見圖2。

2.2.2差異表達(dá)miRNA基因的篩選和靶基因的富集分析 在100 μmol/L青蒿素作用24 h后，與對(duì)照組相比較。HepG2細(xì)胞系中，篩選出上調(diào)miRNA基因43條，下調(diào)基因41條；Huh7細(xì)胞系中，刷選出上調(diào)miRNA基因13條，下調(diào)基因9條，見圖3。在上調(diào)和下調(diào)的miRNA中，篩選出顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的miRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。兩種細(xì)胞系中，相同的差異miRNA有4個(gè)，分別是hsa-miR-32-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-1307-3p，見圖5。

圖2 預(yù)測(cè)Novel miRNA的結(jié)構(gòu)

圖3 差異miRNA火山圖 A：HepG2;B:Huh7

圖4 HepG2和Huh7細(xì)胞中顯著變化的miRNA

A：HepG2和Huh7細(xì)胞中顯著上調(diào)的miRNA；1：hsa-miR-199a-5p；2：Novel_1144；3：Novel_1213；4：hsa-miR-4426；5：hsa-miR-1273g-3p；6：hsa-miR-451a；7：hsa-miR-556-5p；8：hsa-miR-33a-5p；9：hsa-miR-182-3p；10：hsa-miR-328-3p；B：HepG2和Huh7細(xì)胞中顯著下調(diào)的miRNA；1：hsa-miR-4664-5p；2：hsa-miR-195-3p；3：hsa-miR-1276；4：hsa-miR-3679-5p；5：hsa-miR-4454；6：hsa-miR-10b-3p；7：hsa-miR-4671-5p；8：hsa-miR-1247-3p；9：hsa-miR-1269b；10：hsa-miR-1246

圖5 HepG2和Huh7細(xì)胞中相同的差異miRNA

在HepG2和Huh7細(xì)胞系中，挑選了富集前20位的pathway條目在圖6和圖7中進(jìn)行展示。在這些通路中，與HepG2細(xì)胞相關(guān)的為Rap1信號(hào)通路，與Huh7細(xì)胞相關(guān)的為MAPK信號(hào)通路。

圖6 HepG2細(xì)胞候選靶基因KEGG富集散點(diǎn)圖

圖7 Huh7細(xì)胞候選靶基因KEGG富集散點(diǎn)圖

3 討論

肝細(xì)胞肝癌是肝臟最常見的惡性腫瘤之一，是世界死亡率第二的癌癥，嚴(yán)重威脅著人們健康[3]。肝癌起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，僅40%患者能在早期被發(fā)現(xiàn)。但肝癌發(fā)生迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)達(dá)到局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，預(yù)后很差，嚴(yán)重威脅著人們的健康。肝癌的發(fā)生是復(fù)雜的過程，外界刺激導(dǎo)致肝細(xì)胞遺傳性改變，使其增殖、凋亡、結(jié)構(gòu)等發(fā)生異常，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。通過對(duì)肝癌發(fā)生分子機(jī)制的研究，可能為肝癌臨床治療提供新的方法，也是肝癌治療的理論基礎(chǔ)[4]。

miRNA是短小的、非編碼RNA，通常由1～22個(gè)核苷酸組成。目前已發(fā)現(xiàn)超過2 500種人miRNA在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。例如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、自噬、血管生成和代謝[4]。最近，已經(jīng)證明miRNA在人類癌癥中表現(xiàn)出組織和疾病特異性模式，表明miRNA可能是用于HCC的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新型生物標(biāo)志物[5]。

青蒿是一種使用了2 000多年的傳統(tǒng)藥物，對(duì)瘧疾、寄生蟲病和纖維化具有顯著的療效，且毒性低[2]。最近幾年被報(bào)道出具有廣泛的抗腫瘤活性，但在肝癌細(xì)胞上研究較少。本研究表明青蒿素能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2的增殖，且隨著藥物濃度增大，抑制作用隨之增強(qiáng)；在同一藥物濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用也越強(qiáng)。說明青蒿素在肝癌細(xì)胞中是有一定的研究?jī)r(jià)值。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)青蒿素作用于兩種肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2 中的miRNA進(jìn)行測(cè)序并分析了差異表達(dá)miRNA，其中肝癌細(xì)胞Huh7篩選出21個(gè)差異表達(dá)的miRNA，肝癌細(xì)胞HepG2篩選出84個(gè)差異表達(dá)的miRNA，兩種肝癌細(xì)胞相同的差異表達(dá)miRNA共有4個(gè)，分別是miR-32-5p、miR-30e-5p、miR-22-3p和miR-1307-3p，這4個(gè)miRNA可能與青蒿素抑制肝癌細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。研究[6]表明，miR-32-5p在腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，且與膀胱腫瘤的癌癥特異性存活密切相關(guān)。Chen et al[7]發(fā)現(xiàn)，miR-30e-5p與miR-15a一起抑制LRP6的表達(dá)并促進(jìn)GMEC中的脂肪代謝。Chen et al[8]將miR-22-3p鑒定為腫瘤抑制因子，其直接靶向SP1以抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)HCC中的細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。Chen et al[9]發(fā)現(xiàn)miR-1307-3p的表達(dá)可能被認(rèn)為是結(jié)腸癌患者5-FU化療療效的預(yù)測(cè)因子。

近幾年，已經(jīng)證明miRNA涉及許多類型的疾病，尤其是人類惡性腫瘤。許多miRNA在HCC中失調(diào)，這可能對(duì)當(dāng)前的研究有所啟發(fā)。由于miRNA穩(wěn)定且易于檢測(cè)，因此在肝癌組織、血清/血漿和細(xì)胞系中報(bào)道了它們的異位表達(dá)。對(duì)于miRNA在肝癌作用機(jī)制的研究仍然在不斷擴(kuò)展。本研究通過靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示青蒿素在HepG2細(xì)胞中主要調(diào)控Rap1信號(hào)通路，在Huh7細(xì)胞主要調(diào)控MAPK信號(hào)通路，暗示著青蒿素在不同肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制各有不同。有研究表明，Rap1的下調(diào)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡[10]，且Rap1還可以抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[11]。MAPK通路聯(lián)合ERK通路[12]或者RAS通路[13]可以作為肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的預(yù)后標(biāo)志物?；诖罅课墨I(xiàn)報(bào)道，可推測(cè)Rap1信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路在青蒿素抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，大量基因指向多種通路，但具體哪條通路指向青蒿素調(diào)控肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)仍需進(jìn)一步研究。

本研究評(píng)估了在青蒿素作用下HCC中失調(diào)的miRNA的最新數(shù)據(jù)，在肝癌細(xì)胞Huh7中篩選出21個(gè)差異表達(dá)的miRNA，在肝癌細(xì)胞HepG2中篩選出84個(gè)差異表達(dá)的miRNA，兩種肝癌細(xì)胞相同的差異表達(dá)miRNA共有4個(gè)，并回顧了這些miRNA的報(bào)道功能和對(duì)靶基因預(yù)測(cè)進(jìn)行理論分析，推測(cè)它們很有可能適用于青蒿素調(diào)控miRNA治療肝癌的診斷、治療和預(yù)后標(biāo)志物。