劉超猛，李浩浩，王梅子，張桂青

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder, PTSD)是人們經(jīng)歷創(chuàng)傷性應(yīng)激事件后延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的精神障礙[1]，PTSD患者常常伴有記憶損害，可能與其記憶加工過程受阻有關(guān)[2]。作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號傳導(dǎo)通路的重要組成部分，氨基末端激酶(jun N-terminal kinase, JNK)與壓力應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，JNK3信號通路可能介導(dǎo)了海馬神經(jīng)元的凋亡進(jìn)程[3]，研究[4]表明，作為MAPK家族的成員，海馬區(qū)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5, ERK5)的激活對慢性壓力下大鼠的記憶損害起保護(hù)作用，目前有關(guān)PTSD樣大鼠記憶損害分子生物學(xué)方面的研究較少，該研究借助單次延長應(yīng)激刺激(single prolonged stress, SPS)建立PTSD樣大鼠模型，對其記憶損害表現(xiàn)和不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)JNK3/ERK5的差異性表達(dá)做初步觀察，以進(jìn)一步探討PTSD記憶損害的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只健康清潔級雄性SD大鼠，180～220 g，由新疆疾病控制動(dòng)物中心[許可證號：SCXK(新)2018-0001]提供，飼養(yǎng)條件：室溫(25±1)℃，相對濕度50%～60%，嚴(yán)格12 h/12 h光控時(shí)間，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食、飲水，無噪音環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理遵守本單位有關(guān)開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的規(guī)定。

1.2 主要試劑Anti-ERK5兔多克隆抗體、Anti-JNK3兔多克隆抗體(英國abcam公司，貨號ab196609、ab126591)；β-actin內(nèi)參抗體、HPR標(biāo)記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號BM0627、BA1051)；HE染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號C0105)；定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)合成引物(北京擎科生物技術(shù)有限公司)。

1.3 模型制備按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為2組：Control組8只，PTSD組24只(PTSD2 d組、PTSD5 d組和PTSD8 d組，各8只)，借鑒本課題組前期造模方法[5]，通過3個(gè)步驟建立PTSD動(dòng)物模型：① 用高強(qiáng)度聚乙烯薄膜將大鼠完全包裹，僅在口鼻處留幾個(gè)透氣孔，2 h后去除薄膜；② 將大鼠放入25 ℃左右游泳箱中，一陣掙扎后大鼠懸停在水面，取出后用毛巾擦干；③ 將大鼠放入99.5%的無水乙醚麻醉箱中，10 s左右大鼠出現(xiàn)呼吸抑制，不能站立，后將其放置通風(fēng)處。

1.4 模型評估建立PTSD動(dòng)物模型第2天，依次通過拒縛反射測試、曠場實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來評價(jià)兩組大鼠的恐懼反應(yīng)、焦慮水平和空間記憶能力。① 拒縛反射測試：實(shí)驗(yàn)人員佩戴專業(yè)手套抓取大鼠(脊柱和腹部)，觀察其行為表現(xiàn)(抓取不反抗0分；尖叫或回避1分；尖叫并回避2分；掙脫3分；掙脫并尖叫4分；撕咬行為5分；主動(dòng)躍起攻擊6分)；② 曠場實(shí)驗(yàn)：箱體(900 mm×900 mm×500 mm)底部設(shè)有16個(gè)等大方格，曠場上方連接紅外攝像儀，記錄大鼠5 min內(nèi)在曠場中的站立與跨格次數(shù)；③ Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于平臺上熟悉周邊環(huán)境15 s，隨后從非靶象限面壁將其放入池內(nèi)，若大鼠找到平臺則停止實(shí)驗(yàn)，時(shí)間為60 s，若不能找到，引導(dǎo)大鼠游至水下平臺適應(yīng)10 s，共重復(fù)4次，測定平均上臺潛伏期。

1.5 海馬組織提取與HE染色分別于制備PTSD大鼠模型后第2、5和8天，對PTSD2 d、5 d、8 d和Control組(第8天剝離)大鼠采用3%水合氯醛30 mg/kg行腹腔麻醉，固定大鼠剪開胸腔，從右心耳處剪開放血，隨后向大鼠心臟推注30 ml生理鹽水灌洗液，同時(shí)觀察從右心流出的液體是否清亮，后斷頭取腦，迅速剝離海馬組織，兩側(cè)海馬組織分開，一側(cè)置液氮24 h后于-80 ℃冰箱保存，另一側(cè)經(jīng)10%甲醛溶液固定、酒精脫水、浸蠟包埋和切片，常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察Control組和PTSD8 d 組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回(dentate gyrus, DG)組織形態(tài)變化。

1.6 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織JNK3和ERK5 mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取總RNA(取樣本約100 mg)，采用紫外分光光度計(jì)測量總RNA的濃度與純度，當(dāng)260 nm/280 nm在1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃，5 min；50 ℃，15 min；85 ℃，5 min；4 ℃，10 min，β-actin上游引物:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；JNK3上游引物：5′-TGAAGAAATTGCAGCCCACC-3′，下游引物：5′-TCTTCGCTGGGTCAATCACT-3′；ERK5上游引物：5′-CTGACGATGAGCCTGATTGC-3′，下游引物：5′-TGGACACACAGGCTCACTAG-3′。將cDNA稀釋10倍行PCR檢測，反應(yīng)條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)后，借助定量PCR儀(ABI7500)得出每個(gè)樣本的Ct值，實(shí)驗(yàn)組JNK3和ERK5 mRNA 相對于Control組基因表達(dá)倍數(shù)采用2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.7 Western blot法檢測JNK3和ERK5蛋白表達(dá)取海馬標(biāo)本100 mg，用研缽研碎，加400 μl單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中進(jìn)行勻漿，然后置于冰上，裂解30 min后，將裂解液移至1.5 ml離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液分裝于0.5 ml離心管中，后稀釋、孵育，利用OD值測定樣本蛋白濃度，煮沸冷卻備用；制備5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣電泳，電泳結(jié)束，將蛋白轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜上，用5% 脫脂牛奶封閉2 h，孵一抗，洗膜孵二抗(HPR標(biāo)記羊抗小鼠，稀釋比例為1 ∶50 000)2 h，曝光顯色，用BandScan軟件得出膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 拒縛反射評分比較與Control組比較，PTSD組大鼠拒縛反射評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Control組和PTSD組大鼠拒縛反射評分、 站立次數(shù)、跨格次數(shù)和上臺潛伏期的比較

P25表示第1四分位數(shù)，P50表示第2四分位數(shù)，P75表示第3四分位數(shù)

2.2 曠場實(shí)驗(yàn)站立與跨格次數(shù)比較與Control組比較，PTSD組大鼠站立次數(shù)與跨格次數(shù)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 水迷宮定位航行能力比較在Morris水迷宮中行定位航行測試時(shí)，Control組大鼠經(jīng)過短暫的調(diào)整，很快就能找到隱藏在水下20 mm的平臺，典型航行軌跡見圖1A；PTSD組大鼠更多的是圍繞著迷宮內(nèi)壁打轉(zhuǎn)，見圖1B；與Control組比較，PTSD組大鼠平均上臺潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 Control組和PTSD組大鼠在水迷宮中航行示意圖A: Control組; B:PTSD組

2.4 海馬組織HE染色結(jié)果與Control組大鼠海馬組織CA1區(qū)和CA3區(qū)比較，PTSD8 d組CA1區(qū)和CA3區(qū)海馬神經(jīng)元排列紊亂，結(jié)構(gòu)異常，染色不均，且胞核和胞質(zhì)界限較模糊，見圖2A、2B、2D、2E；與Control組大鼠海馬組織DG區(qū)相比，PTSD8 d組DG區(qū)海馬神經(jīng)元排列紊亂，結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)元數(shù)量大量減少，胞核和胞質(zhì)界限模糊，見圖2C、2F。

2.5 大鼠海馬組織JNK3/ERK5 mRNA水平表達(dá)4組大鼠海馬組織JNK3/ERK5 mRNA 水平表達(dá)存在差異(F=7.42,P<0.05;F=16.33,P<0.05)。與Control組(0.123±0.016)相比，PTSD2 d組(0.212±0.056)、PTSD5 d組(0.188±0.033)大鼠海馬組織JNK3 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTSD8 d組(0.134±0.025)與Control組相比，JNK3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PTSD2 d、5 d和8 d組JNK3 mRNA表達(dá)量呈下降趨勢，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Control組(0.135±0.033)比較，PTSD2 d組(0.204±0.048)、PTSD5 d組(0.290±0.045)和PTSD8 d組(0.377±0.059)大鼠海馬組織ERK5 mRNA的表達(dá)升高，且依次增多，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 大鼠海馬組織JNK3/ERK5蛋白水平表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， PTSD2 d組、PTSD5 d組JNK3蛋白表達(dá)較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTSD8 d組與Control組相比，JNK3 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PTSD2 d、5 d和8 d組ERK5蛋白表達(dá)較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

PTSD的一個(gè)重要特征在于其對學(xué)習(xí)記憶能力的破壞，學(xué)習(xí)記憶能力受損又加重了其恐懼和焦慮樣表現(xiàn)[6]。在本次研究中，與Control組大鼠比較，PTSD組大鼠拒縛反射評分增高，表明其恐懼反應(yīng)明顯；在曠場實(shí)驗(yàn)中的站立和跨格次數(shù)減少，表明其自主探索欲望減退，意志活動(dòng)減弱，情緒喚醒水平降低，而情緒喚醒水平的高低與記憶的效果密切相關(guān)[7]；在Morris水迷宮中平均上臺潛伏期延長，表明其空間記憶能力減退；HE染色后PTSD組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，結(jié)構(gòu)異常，特別是DG區(qū)，神經(jīng)元數(shù)量大量減少，表明經(jīng)歷復(fù)合應(yīng)激后，PTSD大鼠海馬神經(jīng)元排列已經(jīng)偏離了其獨(dú)特的高度有序的板層構(gòu)筑結(jié)構(gòu)。本研究通過束縛、強(qiáng)制游泳和乙醚麻醉等方式成功制備了具有恐懼、焦慮等情緒記憶和空間記憶能力受損類似臨床上PTSD患者核心癥狀的大鼠模型，達(dá)到了以往課題組有關(guān)PTSD大鼠模型制備標(biāo)準(zhǔn)[5]。

圖2 大鼠海馬組織HE染色情況 ×400

A～C：分別為Control組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區(qū)示意圖；D～F：分別為PTSD8 d 組大鼠海馬組織CA1、CA3和DG區(qū)示意圖

圖3 大鼠海馬組織 JNK3和ERK5的表達(dá)

1:Control組;2:PTSD2 d組;3:PTSD5 d組;4:PTSD8 d組;與Control組比較:*P<0.05

海馬體是學(xué)習(xí)與記憶的樞紐，主要負(fù)責(zé)長時(shí)程記憶的存儲與轉(zhuǎn)換。學(xué)習(xí)記憶又與神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)受體、神經(jīng)遞質(zhì)代謝水平密切相關(guān)[8]，JNK信號通路，由JNK1、JNK2和JNK3組成，而JNK3僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)，激活后的JNK借助Bcl-2、Caspase-3等信號通路介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[9]，Kuan et al[10]研究表明，抑制JNK3基因的活化轉(zhuǎn)錄能有效提高神經(jīng)細(xì)胞的生存率。本次研究觀察了建立PTSD模型后大鼠1周內(nèi)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬組織中JNK3 mRNA及蛋白的動(dòng)態(tài)變化，相比于Control組，PTSD2 d 組和5 d 組JNK3 mRNA及蛋白表達(dá)均升高，這與田和平 等[11]研究結(jié)果類似，可能是創(chuàng)傷早期大鼠海馬區(qū)JNK3的大量表達(dá)介導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡過程；值得注意的是，從PTSD第2、5和8天整個(gè)時(shí)間軸來看，JNK3 mRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)了一個(gè)增多漸緩的趨勢，與Control組比較，PTSD8 d組大鼠海馬組織JNK3 mRNA及蛋白的表達(dá)差異已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的大量損傷與凋亡激活了大鼠相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)保護(hù)通路，減少了JNK3 mRNA及蛋白的表達(dá)。

Su et al[12]研究表明，ERK5可通過調(diào)控過氧化氫和神經(jīng)生長因子的表達(dá)來介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的“預(yù)處理”保護(hù)機(jī)制，Akyol et al[13]研究顯示，ERK5可通過激活原肌球蛋白受體激酶C(TRKC)來介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)對腦損傷大鼠神經(jīng)功能的改善作用，以上均說明ERK5在神經(jīng)系統(tǒng)損傷進(jìn)程中起介導(dǎo)保護(hù)作用。在本次研究中，相比于Control組，PTSD2 d、5 d和8 d 組大鼠海馬組織ERK5 mRNA及蛋白表達(dá)水平逐步升高，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)因子JNK3的表達(dá)逐漸減少，故ERK5可能是通過抑制JNK3的表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的。

由于雌鼠在其性周期內(nèi)激素水平變化會對JNK3/ERK5的表達(dá)產(chǎn)生影響，所以本研究全部選用雄性SD大鼠，但限于條件，未能觀察到JNK3與ERK5在各自上下游調(diào)控通路中是如何發(fā)揮作用的，較小的樣本量可能對研究結(jié)論也有一定影響，這也為下一步的研究提供了方向。