劉小花， 師志強(qiáng)， 牟亞轉(zhuǎn)， 周湘琳， 封士蘭

(蘭州大學(xué) 藥學(xué)院， 蘭州 730000)

0 引 言

藥學(xué)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科?，F(xiàn)階段藥學(xué)實(shí)驗(yàn)課程基本是在各二級學(xué)科的基礎(chǔ)上開設(shè)的，學(xué)科間的知識點(diǎn)滲透較少，涉及知識的深度和廣度不夠，教學(xué)過程中無法體現(xiàn)其系統(tǒng)性和連貫性[1-8]。這就迫切地需要從藥物的研究與開發(fā)過程中研發(fā)一些一體化綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，將藥學(xué)各門專業(yè)課程有機(jī)整合起來，從而提高學(xué)生的創(chuàng)新能力與綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/p>

1 貞芪扶正顆粒制備一體化綜合實(shí)驗(yàn)簡介

貞芪扶正顆粒具有良好的臨床效果[9-13]，其制備過程(見圖1)可以開發(fā)成一個一體化綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。項(xiàng)目的實(shí)施是以制備貞芪扶正顆粒為目標(biāo)產(chǎn)物，第1步是從原料藥開始質(zhì)量追蹤檢驗(yàn)，其處方中的黃芪和女貞子分別按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)[14]；第2步是貞芪扶正顆粒的提取與制備，將黃芪和女貞子進(jìn)行煎煮提取，濃縮成稠膏，干燥成中間體粉末，再加一定輔料，制成顆粒，成品要求檢驗(yàn)合格。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過藥物分析技術(shù)及時(shí)獲取產(chǎn)品質(zhì)量信息，保證實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)合理和實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量合格。

圖1 貞芪扶正顆粒的一體化實(shí)驗(yàn)流程圖

通過貞芪扶正顆粒制備一體化綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開展，可將藥學(xué)各門專業(yè)課程有機(jī)整合起來(見圖2)，對學(xué)生鞏固所學(xué)知識、培養(yǎng)創(chuàng)新精神、提高動手能力及解決問題能力都有顯著成效。

圖2 一體化實(shí)驗(yàn)所連接的課程流程圖

2 原料藥的檢驗(yàn)

2.1 黃芪的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用黃芪藥材為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus( Bge.) Hsiao的干燥根。

(1) 性狀判別[14]。 使學(xué)生學(xué)習(xí)了解黃芪外觀、形狀、顏色、質(zhì)地、有無纖維、氣味等性狀特征。

(2) 粉末特征鑒別。依照中國藥典2015版[14]黃芪項(xiàng)下規(guī)定鑒別，學(xué)生應(yīng)認(rèn)識黃芪中石細(xì)胞、網(wǎng)紋導(dǎo)管和纖維等典型的粉末特征圖(見圖3)。

石細(xì)胞

網(wǎng)紋導(dǎo)管

黃芪纖維

(3) 薄層鑒別。方法依照中國藥典2015版黃芪項(xiàng)下的規(guī)定，點(diǎn)樣量為2 μL，在硅膠G 薄層板，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液，顯示劑為10 %硫酸乙醇溶液，在105 °C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光燈(365 nm)下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，如圖4所示。

(4) 水分測定。 測定的水分為7.8%(<10.0%, 通則0832第2法), 符合規(guī)定。

(5) 總灰分測定。測定總灰分為4.5%(<5.0 %，通則2302)，符合規(guī)定。

(6) 浸出物測定。 按照水溶性浸出物測定法(通則2201)項(xiàng)下的冷浸法測定浸出物為20.4%，>17.0%，浸出物符合規(guī)定。

(a) 日光下

(b) 365 nm紫外光下

1-黃芪甲苷； 2-黃芪藥材； 3-貞芪扶正有糖顆粒； 4-貞芪扶正無糖顆粒

(7) 黃芪甲苷含量測定。 按照高效液相色譜法(通則0512)測定。根據(jù)中國藥典2015版黃芪項(xiàng)下黃芪甲苷含量測定項(xiàng)規(guī)定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(32∶68)為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。 本品按干燥品計(jì)算，黃芪甲苷(C41H68014)平均含量為0. 051%，>0.040%，說明黃芪藥材中黃芪甲苷的含量符合規(guī)定，如圖5所示。

圖5 黃芪藥材中黃芪甲苷的HPLC圖(ELSD檢測器)

(8) 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定。 按照高效液相色譜法(通則0512)測定。根據(jù)中國藥典2015版黃芪項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定規(guī)定，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A ，以0.2 %甲酸溶液為流動相B，0～20 min，流動相A 20%勻速上升至40%，20～30 min，流動相A40%，等度洗脫；檢測波長為260 nm。 本品按干燥品計(jì)算，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(C22H22O10) 平均含量為0.033%，>0.020%，說明黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量符合2015版藥典規(guī)定，如圖6所示。

圖6 黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的HPLC圖(DAD檢測器)

2.2 女貞子的檢驗(yàn)[14]

實(shí)驗(yàn)所用女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit. 的干燥成熟果實(shí)。

(1) 性狀鑒別。學(xué)生可根據(jù)中國藥典要求認(rèn)識女貞子的性狀。

(2) 粉末特征鑒別[14]。通過此實(shí)驗(yàn)學(xué)生可觀察到女貞子的種皮細(xì)胞、內(nèi)果皮纖維等粉末特征(見圖7)，從而將藥用植物學(xué)、生藥學(xué)的一些技術(shù)和方法應(yīng)用實(shí)踐中。

圖7 女貞子粉末特征圖

(3) 化學(xué)鑒別[14]。依照中國藥典女貞子項(xiàng)下的鑒別方法檢驗(yàn)，對供試品溶液和對照品溶液進(jìn)行制備，照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，點(diǎn)樣量為1 μL，薄層板為硅膠G板，展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸(40∶1∶1)，顯色劑為10% 硫酸乙醇溶液，在110 °C加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰。如圖8所示，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

(4) 雜質(zhì)、水分和總灰分檢查。檢査雜質(zhì)為2.4%(<3 %,通則2301)；水分為5.6%(<8.0 %,通則0832第2法)；總灰分為4.5%(<5.5%,通則2302)。雜質(zhì)、水分和總灰分全部符合規(guī)定。

(5) 浸出物測定。按照醇溶性浸出物測定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測定，用30 %乙醇作溶劑，醇浸出物為30.4%(>25.0%)，符合規(guī)定。

圖8 女貞子藥材TCL圖

(6) 含量測定。 按照高效液相色譜法(通則0512)測定[14]。依照中國藥典女貞子項(xiàng)下含量測定方法，以甲醇-水(40∶60)為流動相；檢測波長為224 nm。本品按干燥品計(jì)算，特女貞苷(C31H42017)的平均含量為1.32%(>0.70%)，說明女貞子藥材中特女貞苷的含量符合規(guī)定，如圖9所示。

圖9 女貞子藥材的HPLC圖(DAD檢測器)

3 貞芪扶正顆粒的制備及檢測

3.1 制 法[15]

黃芪和女貞子，加水煎煮3次，合并煎液，過濾，濾液濃縮，干燥，加輔料適量，制成顆粒，干燥，分裝。

3.2 性 狀

本品為黃棕色顆粒；味甜(含糖型)或味微苦(無糖型)。

3.3 鑒 別

取含量測定項(xiàng)下的供試品溶液，用黃芪藥材的薄層鑒別條件展開和顯色。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn)；紫外光燈(365 nm)下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)(見圖4)。

3.4 檢 查

應(yīng)符合顆粒劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(附錄IC)。

(1) 粒度照粒度和粒度分布測定法。(通則0982第二法雙篩分法)測定，不能通過一號篩與能通過五號篩的總和不得超過15%，制備的有糖和無糖顆粒均符合規(guī)定。

(2) 水分。中藥顆粒劑照水分測定法(通則0832)測定，有糖顆粒的水分為7.1%，無糖顆粒的水分為6.4%，均不超過8.0%，符合規(guī)定。

(3) 貞芪扶正有糖及無糖顆粒的溶化性均符合規(guī)定。

3.5 含量測定[16]

(1) 色譜方法[16]。SpursilTM C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和水，梯度洗脫；柱溫30℃；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL； ELSD溫度為112.8 ℃，載氣流速3.2 L/min。色譜圖見圖10、11。

圖10 貞芪扶正顆粒與藥材及對照品的HPLC-DAD圖(254 nm)

圖11 貞芪扶正顆粒與各對照品的HPLC-ELSD圖

(2) 樣品溶液制備方法[17]。取貞氏扶正顆粒約15 g(無糖型5 g)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇150 mL溶解，加氨水15 mL，超聲波1 h，濾過，濾液濃縮至干，加20 mL水溶解后，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

(3) 制劑含量測定。本品有糖顆粒每袋黃芪甲苷(C41H68O14)平均含量為1.23 mg，無糖顆粒每袋黃芪甲苷(C41H68O14)平均含量為1.24 mg，均>0.6 mg，說明制劑含量測定合格。

(4) 含量測定。采用HPLC-DAD-ELSD連用技術(shù)，可同時(shí)測定黃芪甲苷、特女貞苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷3種成分含量。通過色譜峰的變化可比對原料藥與制劑的化學(xué)成分變化。

4 實(shí)驗(yàn)效果與討論

貞芪扶正顆粒的一體化綜合實(shí)驗(yàn)是按照藥學(xué)技術(shù)的系統(tǒng)性和內(nèi)在聯(lián)系組織實(shí)驗(yàn)教學(xué)，從中藥材原生物狀態(tài)到制成藥品的全過程，體現(xiàn)藥物研究、開發(fā)、應(yīng)用的規(guī)律性以及技能的實(shí)用性，使學(xué)生了解并掌握藥物研究的基本過程和操作方法。

本項(xiàng)目從中藥原生植物黃芪和女貞子的認(rèn)識開始，到生產(chǎn)到合格的藥品截止，共分為若干個階段。該實(shí)驗(yàn)可以將藥用植物學(xué)與生藥學(xué)、天然藥物化學(xué)、藥物分析學(xué)、中藥制劑分析、藥劑學(xué)等各門課程串聯(lián)起來，培養(yǎng)學(xué)生掌握知識的綜合能力以及對綜合知識的應(yīng)用能力。

目前貞芪扶正顆粒試行衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)，含量測定方法使用薄層掃描法測定黃芪甲苷含量，而本項(xiàng)目采用HPLC法測定黃芪甲苷含量，比法定標(biāo)準(zhǔn)先進(jìn)和準(zhǔn)確。

學(xué)生通過對文獻(xiàn)的查閱；按照國家標(biāo)準(zhǔn)對原料藥黃芪和女貞子進(jìn)行檢驗(yàn)，合格后才能對其進(jìn)行煎煮提取，濃縮成稠膏，干燥，加一定輔料，制成顆粒，檢驗(yàn)合格后，才能成為貞芪扶正顆粒的藥品。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過藥物分析技術(shù)及時(shí)獲取產(chǎn)品質(zhì)量信息，保證實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)合理、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量合格。 其中貞芪扶正顆粒的制備作為一體化實(shí)驗(yàn)的主線，是整個實(shí)驗(yàn)的匯聚點(diǎn)。

在實(shí)驗(yàn)室條件下制備顆粒，由于實(shí)驗(yàn)室的潔凈度不夠，因此制劑中微生物檢驗(yàn)可能不合格，但制得的制劑并不食用，只是注重培養(yǎng)學(xué)生了解和掌握藥品生產(chǎn)的全過程。盡管由于實(shí)驗(yàn)室條件達(dá)不到藥品生產(chǎn)的條件，有一些缺點(diǎn)，但通過該項(xiàng)目的建設(shè)，打破了傳統(tǒng)的藥學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，使各自為政的隸屬于不同研究所的師資人員得到整合；學(xué)生對各種藥學(xué)專業(yè)儀器設(shè)備的使用與操作，使隸屬于各個研究所的儀器資源得到共享。

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用的黃芪藥材購買時(shí)有重金屬及有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的限量報(bào)告，其符合2015版藥典規(guī)定。且一體化實(shí)驗(yàn)課時(shí)有限，所以此項(xiàng)目沒有設(shè)計(jì)黃芪藥材重金屬及有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的檢查項(xiàng)目。

5 結(jié) 語

該一體化實(shí)驗(yàn)無論從內(nèi)容、方法的組合，實(shí)驗(yàn)手段的更新，還是知識面的擴(kuò)展，都比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)越，對學(xué)生鞏固所學(xué)知識、培養(yǎng)創(chuàng)新精神、提高動手能力及解決問題的能力等方面都有很大促進(jìn)。它是基于教學(xué)大綱的要求，在一個集中的時(shí)間內(nèi)對所學(xué)知識進(jìn)行系統(tǒng)化的匯總和串聯(lián)，學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)鞏固了在前幾個學(xué)期所學(xué)的專業(yè)課程，起到總復(fù)習(xí)的作用，并從藥學(xué)學(xué)科的整體層面理解科學(xué)研究的方法，有利于學(xué)生畢業(yè)實(shí)習(xí)和畢業(yè)前進(jìn)行的課題設(shè)計(jì)，有利于學(xué)生在以后的工作崗位或?qū)W習(xí)深造中快速上手和操作。