周 洲

(南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210021)

0 引 言

苯硫脲(Phenylthiocarbamide，PTC)是一種人工合成的白色晶體化合物，因含有N—C=S基團(tuán)而有苦澀味。PTC嘗味能力主要受位于人類7號(hào)染色體上的TAS2R38基因影響，嘗味者與味盲者主要區(qū)別在于TAS2R38基因編碼區(qū)145位(C/G)、785位(C/T)和886位(G/A)三處存在單核苷酸多態(tài)性(SNPs)[1]，屬于常染色體不完全顯性遺傳。PTC嘗味實(shí)驗(yàn)是遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，主要用于學(xué)習(xí)基因在群體水平上的傳遞規(guī)律[2-11]。該實(shí)驗(yàn)采用閾值法檢測(cè)學(xué)生PTC嘗味能力，然后根據(jù)首次嘗出苦味的溶液編號(hào)確定其基因型，并計(jì)算出基因頻率和基因型頻率，最后分析其是否處于遺傳平衡狀態(tài)。但之前已有研究顯示,PTC嘗味能力是受多基因控制[8,12]，實(shí)踐調(diào)查也表明PTC嘗味能力并不完全符合單基因孟德爾遺傳規(guī)律[13]，如父母雙方基因型都為tt，子代基因型卻為Tt。另外，PTC的苦澀味重并具有毒性，結(jié)果易受心理因素干擾[14]，學(xué)生對(duì)其比較排斥，實(shí)踐中不愿意認(rèn)真配合調(diào)查工作。本文對(duì)PTC嘗味實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，首先改進(jìn)實(shí)驗(yàn)材料獲取方法，而后選擇合適PCR引物擴(kuò)增TAS2R38苦味基因，最后采用RFLP法確定被調(diào)查者的基因型，從而獲得更為準(zhǔn)確與科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

(1) 實(shí)驗(yàn)對(duì)象。受試者為在校大學(xué)生，年齡為19～20周歲。

(2) 實(shí)驗(yàn)試劑。PTC梯度稀釋液；50 mmol/L NaOH；1 mol/L Tris-Cl (pH8.0)；PCR試劑盒(上海生工)；PCR引物(上海生工合成)：引物1(5′-CCTTCGTTTTCTTGGTGAATTTTTGGGATGTAGTGAAG-AGGCGG-3′)；引物2(5′-AGGTTGGCTTGGTTTGCAA-TCATC-3′)；QDL2000 Quantitative DNA Marker (Takara)；內(nèi)切酶Hae III (Takara)等。

(3) 實(shí)驗(yàn)儀器。水平電泳槽、微波爐、微量移液器、PCR儀、紫外透射儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 閾值法

按相關(guān)教材方法配制PTC梯度溶液(1～14)[2-11]，測(cè)試者首先從14號(hào)管液體滴加于受試者舌根處，令其緩緩咽下品嘗，測(cè)試者應(yīng)盡量避免受試者看到標(biāo)簽。詢問受試者能否準(zhǔn)確鑒別兩種溶液的味道，若不能鑒別或鑒別不準(zhǔn)，此依次用13、12號(hào)液體重復(fù)，直至能明確鑒別出PTC的苦味為止；當(dāng)受試者鑒別出某一號(hào)液體時(shí)，應(yīng)用此號(hào)溶液重復(fù)嘗味3次，3次結(jié)果一樣時(shí)，結(jié)果才可靠。根據(jù)受試者最初覺察苦味溶液的編號(hào)，查對(duì)照表查出相應(yīng)的基因型并做記錄。

2.2 PCR-RFLP法

2.2.1 口腔黏膜細(xì)胞收集

(1) 實(shí)驗(yàn)室取樣。取出0.2 μL PCR管，在PCR管加入50 μL 50 mmol/L NaOH溶液；用純凈水輕微漱口，用無菌牙簽輕刮臉頰內(nèi)壁多次，將刮取物置于NaOH溶液中攪動(dòng)釋放細(xì)胞，然后棄去牙簽。

(2) 校園調(diào)查取樣。吸取1 mL無水乙醇于1.5 mL離心管中；被調(diào)查者用純凈水輕微漱口，用牙簽輕刮臉頰內(nèi)壁多次，將刮取物置于無水乙醇中；剪去不含刮取物的多余牙簽部分，蓋緊管蓋后，帶回實(shí)驗(yàn)室；置于旋渦混合器上振蕩30 s，打開管蓋后用棄去牙簽；蓋緊管蓋后，3 000 r/min離心10 min，輕輕傾倒掉上清液，可用移液器輕輕吸取剩下上清液，將離心管倒扣在無菌濾紙上空氣晾干，或置于真空干燥儀中快速干燥；加入50 μL 50 mmol/L NaOH溶液，用移液器吹打沉淀，然后將混合液轉(zhuǎn)移至0.2 mL PCR管中。

2.2.2 模板DNA直接制備

將PCR管短暫離心后，置于PCR儀中，95 ℃下裂解10 min；取出PCR管，加入5 μL 1 mol/L Tris-Cl (pH8.0)緩沖液(1/10體積)，混勻后即為用于PCR的模板DNA。

2.2.3 PCR擴(kuò)增

在冰上放置1.5 mL離心管，PCR試劑解凍后立即置于冰上，鑒于溶液黏性造成誤差，先按PCR反應(yīng)所需量配制除DNA模板以外總的混合液，然后在0.2 μL PCR管中精確分成相應(yīng)等份，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)單獨(dú)添加模板。30 μL PCR反應(yīng)體系：5 μL DNA模板，3 μL 10×buffer (1×)，1.8 μL MgCl2(1.5 mmol/L)，2.4 μL dNTPs (0.2 mmol/L)，0.6 μL引物1 (0.2 μmol/L)，0.6 μL引物2 (0.2 μmol/L)，0.2 μL Taq酶(1.0U)，16.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，67 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min，結(jié)束后取出樣品4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 PCR產(chǎn)物濃度測(cè)定

采用4 ℃保存的2.5%瓊脂糖凝膠和緩沖液進(jìn)行電泳檢測(cè)，加樣時(shí)將PCR產(chǎn)物與Marker共同點(diǎn)樣，以5 μL QDL2000 Quantitative DNA Marker上樣量為例，2 000、1 000、750、500、250、100 bp條帶的DNA量分別為200、100、75、50、25以及10 ng；100～150 V電泳檢測(cè)30～40 min；根據(jù)Marker和PCR產(chǎn)物電泳條帶的大小與亮度，觀察與估算PCR產(chǎn)物的大小與濃度。

2.2.5 酶切反應(yīng)與檢測(cè)

使用限制性內(nèi)切酶Hae III對(duì)TAS2R38基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化。20 μL酶切反應(yīng)體系：17 μL PCR產(chǎn)物(≤1 μg)，2 μL 10×M Buffer (1×)，1 μL Hae III內(nèi)切酶(10U)，37 ℃溫育3～4 h，最后取出樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。采用4 ℃保存的2.5%瓊脂糖凝膠和緩沖液進(jìn)行電泳檢測(cè)，酶切結(jié)果檢測(cè)上樣量為20 μL，100～150 V電泳檢測(cè)40～50 min，最終根據(jù)Marker和酶切結(jié)果確定基因型。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 電泳結(jié)果

在凝膠成像系統(tǒng)下觀察與拍照，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖3所示，PCR預(yù)期產(chǎn)物為221 bp的DNA條帶，接近于Marker的250 bp條帶，其中圖1為實(shí)驗(yàn)室取樣，圖3為校園調(diào)查取樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不管是何種取樣方法，都可以擴(kuò)增出221b目的片段。圖2和圖4分別為圖1和圖3的酶切電泳檢測(cè)結(jié)果，顯性基因T經(jīng)過Hae III酶切后，長(zhǎng)度變?yōu)?77和44 bp，Hae III無法酶切隱性基因t，因此僅出現(xiàn)177 bp片段則說明是TT基因型；出現(xiàn)221和177 bp片段出現(xiàn)則說明是Tt基因型；僅出現(xiàn)221 bp片段則說明是tt基因型；其中44 bp的DNA片段太短，比較靠前，容易與PCR引物二聚體混在一起，所以無需依據(jù)它的存在與否確定PTC基因型。

3.2 實(shí)驗(yàn)討論

采用半定量分子Marker主要是用于確定PCR產(chǎn)物含量問題。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，20μL PCR產(chǎn)物的DNA含量達(dá)不到1 μg，因此以后開展此實(shí)驗(yàn)時(shí)，可采用其他常規(guī)分子Marker。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中同時(shí)采用閾值法與PCR-RFLP法檢測(cè)TAS2R38基因型，發(fā)現(xiàn)約有19%的同學(xué)的嘗味結(jié)果與基因分型結(jié)果不一致，這也說明PTC嘗味能力不符合單基因遺傳規(guī)律。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容理應(yīng)與最新科學(xué)研究成果相一致，不能因?yàn)橹暗姆椒ㄏ鄬?duì)簡(jiǎn)便，就仍然堅(jiān)持采用舊內(nèi)容與方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)。采用PCR-RFLP法帶來的問題是學(xué)生缺乏直觀體驗(yàn)，由于十字花科蔬菜中的苦味物質(zhì)含有N—C=S基團(tuán)，因此可調(diào)查學(xué)生對(duì)十字花科蔬菜的嗜好性，如蘿卜、卷心菜、西蘭花等，在調(diào)查時(shí)要求被調(diào)查者如實(shí)填寫，例如明顯能夠感覺到苦味為超敏感，偶爾能感覺到的為一般敏感，沒有感覺的為不敏感，學(xué)生可直觀感受TAS2R38基因型與此類蔬菜嗜好性的相關(guān)性，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣和增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

圖1 實(shí)驗(yàn)室取樣PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 實(shí)驗(yàn)室取樣酶切結(jié)果

圖3 校園取樣PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖4 校園取樣酶切結(jié)果

4 結(jié) 語

傳統(tǒng)的閾值法即便采用毒性較小的PROP代替PTC進(jìn)行嘗味能力調(diào)查，在用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，仍存在之前的問題，同時(shí)該試劑也存在其它缺點(diǎn)，如測(cè)量區(qū)間更窄，不同基因型對(duì)應(yīng)溶液存在重疊，若要細(xì)分出不同基因型，需要與NaCl溶液配合使用，被測(cè)試者需反復(fù)品嘗這兩個(gè)溶液并做比較，從而難以獲得準(zhǔn)確結(jié)果數(shù)據(jù)[1]。本實(shí)驗(yàn)方法主要通過收集被調(diào)查者口腔粘膜細(xì)胞，采用直接法快速獲取模板DNA，從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)材料的收集，方便學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與開展校園調(diào)查，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑和儀器要求較低，大多數(shù)高校都可以開設(shè)此實(shí)驗(yàn)。