李懷偉,張 朋,仝桂平,馬昌豪,牛紅霞

(菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274000)

桂附地黃丸(濃縮丸)由熟地黃、附子(制)、肉桂、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓8味中藥材組成，用于腎陽(yáng)不足，腰膝酸冷,肢體浮腫，小便不利或反多，痰飲喘咳，消渴[1]。方中山茱萸具補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效，馬錢(qián)苷為其主要活性成分之一[2-3]；肉桂具有補(bǔ)火助陽(yáng)、散熱止痛、溫通經(jīng)脈的功效，主要活性成分為揮發(fā)油中的桂皮醛[4-5]；牡丹皮有清熱涼血、活血化瘀的功效，主要活性成分為芍藥苷和丹皮酚[6]。本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桂附地黃丸(濃縮丸)中馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚的含量，能夠比較全面的控制桂附地黃丸(濃縮丸)的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；XS105 DualRange型十萬(wàn)分之一天平(METTLER TOLEDO)；FRQ-1006HT型超聲波清洗器(杭州法蘭特)。

1.2 藥品與試劑

甲醇、乙腈、磷酸(色譜純 科密歐公司)；超純水；馬錢(qián)苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111640-201005)；桂皮醛(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110710-201720)；芍藥苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201842)；丹皮酚(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110708-201407)；桂附地黃丸(濃縮丸)(市售，批號(hào)180301,180401,180403)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚各適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢(qián)苷0.2089 mg、桂皮醛0.2006mg、芍藥苷0.2082mg、丹皮酚0.3026mg的貯備液，再取貯備液適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢(qián)苷20.89 μg、桂皮醛20.06 μg、芍藥苷20.82 μg、丹皮酚30.26 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱(chēng)取，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min(功率500 W，頻率25 kHz)，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性溶液的制備

按工藝方法制備缺山茱萸、肉桂和牡丹皮的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，0.3%磷酸為流動(dòng)性B，梯度洗脫(0～20 min，11%A；20～35 min,11%→18%A；35～45 min，18%A；45～46 min，18%→40%A；46～60 min40%A)；流速1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液，依“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚與其它峰分離較好，供試品與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚色譜峰保留時(shí)間一致；而陰性樣品溶液在此保留時(shí)間無(wú)相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，表明沒(méi)有其它成分干擾。目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度均>1.5，理論塔板數(shù)均不低于5000，方法適用性良好。

A：混合對(duì)照品溶液；B：供試品溶液；C：陰性樣品溶液；1：馬錢(qián)苷；2：芍藥苷；3：桂皮醛；4：丹皮酚

圖1 混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。各成分在相應(yīng)范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表1 回歸方程及線性范圍

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚的RSD分別為0.15 %、0.33 %、0.09 %、0.62 %(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品(180301)6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算含量，馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚的RSD分別為0.60 %、0.51 %、0.37 %、0.22 %(n=6)，表明方法有較好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在0，4，8，12，24，48 h時(shí)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得供試品中馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.13 %、0.71 %、0.21 %、0.62 %(n=6)，表明供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的供試品(馬錢(qián)苷0.6032 mg·g-1，桂皮醛0.1084 mg·g-1，芍藥苷0.8626 mg·g-1，丹皮酚1.8930 mg·g-1)6份，每份約1.0g，精密加入等量的馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品，分別制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚的回收率分別為99.60 %、96.96 %、99.32 %、98.86%；RSD分別為0.72 %、1.51 %、0.55 %、1.47 %。

2.4 含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算四種活性成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本研究考察了加熱回流和超聲提取兩種方法，提取結(jié)果無(wú)顯著差異，最終選用簡(jiǎn)單省時(shí)的超聲提取方法。采用DAD全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚的最大吸收波長(zhǎng)分別為240 nm、290 nm、230 nm、274 nm，為了方便測(cè)定同時(shí)保證檢測(cè)靈敏度，最終選擇240nm作為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。根據(jù)4種活性物質(zhì)的性質(zhì)，在流動(dòng)相比例選擇中，參照《中國(guó)藥典》2015年版一部[7]考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等多種比例的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以乙腈和0.3 %磷酸為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，供試品和對(duì)照品溶液的色譜峰分離效果最好。

本研究通過(guò)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定馬錢(qián)苷、桂皮醛、芍藥苷和丹皮酚四種成分的含量，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。該方法專(zhuān)屬性、穩(wěn)定性較好，準(zhǔn)確度高且方便快捷，能較好的反映桂附地黃丸(濃縮丸)的質(zhì)量狀況，為該藥品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。