崔亞玲，胡 北，姚 東，薄桂宇，許子華

0 引言

補(bǔ)陽還五湯源自于清代王清任之《醫(yī)林改錯》，配方為黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁7味中藥，主要用于治療中風(fēng)后出現(xiàn)的半身不遂，口歪眼斜，嘴角流涎，小便次數(shù)增加或尿失禁，舌頭暗淡，舌苔變白，脈緩無力。臨床常用于心腦血管意外出現(xiàn)的后遺癥、小兒麻痹后遺癥及冠心病的治療。同樣適用于由其他原因引發(fā)的偏癱、截癱、單側(cè)上肢/下肢萎軟等氣虛血淤者。臨床應(yīng)用多年，療效確切，現(xiàn)根據(jù)臨床需要研制成醫(yī)院顆粒制劑。本研究采用薄層色譜法對處方中黃芪、赤芍及地龍藥材進(jìn)行了定性鑒別，采用HPLC-蒸發(fā)光檢測法對黃芪中黃芪甲苷進(jìn)行定量，方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津L-16)；蒸發(fā)光散色檢測器(MODEL 100，美國索福特公司)；紫外線分析燈85-52015(德國Heraeus公司)；電子分析天平160 g/0.1(北京島津公司)；電子分析天平120 D(北京島津公司)；電熱恒溫二孔水浴鍋(天津泰斯特公司)。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(批號：110781-201616)，地龍對照藥材(批號：120987-201508)，赤芍對照藥材(批號：121093-200402)，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純，Sigma公司)，其他試劑均為分析純；重蒸水(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自制)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；補(bǔ)陽還五顆粒(規(guī)格：15 g/袋，北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自制，批號：20180525、20180717、20180904)。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別方法

2.1.1 黃芪薄層鑒別 取補(bǔ)陽還五顆粒30 g，研細(xì)，加甲醇30 ml，加熱回流1 h，濾液水浴加熱蒸干，殘?jiān)铀?0 ml溶解，用乙醚20 ml/次，洗滌2次，棄去乙醚層，水層用水飽和正丁醇溶液20 ml/次，萃取3次，合并萃取液，用20 ml氨水洗滌4次，取正丁醇層水浴蒸干，加甲醇1 ml使溶解，得供試品溶液[1-2]。除黃芪外，取按處方比例的其他藥材，按照制備工藝制備顆粒，按上述制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加入甲醇，制成1 mg/ml的對照品溶液。照薄層色譜法[3]，吸取供試品和陰性溶液各5 μl、對照品2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7.5∶20∶11∶5)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃溫度下加熱至斑點(diǎn)清晰。3批供試品色譜中，在與黃芪甲苷對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1。(實(shí)驗(yàn)條件：T 25 ℃，RH 65%)。

圖1 黃芪薄層色譜鑒別

2.1.2 地龍薄層鑒別 取補(bǔ)陽還五顆粒50 g，研細(xì)，加二氯甲烷100 ml，加熱回流40 min，濾過，濾液水浴加熱蒸干，殘?jiān)佣燃淄?.5 ml使溶解，作為供試品溶液。除地龍外，取按處方比例的其他藥材，按照制備工藝制備顆粒，按上述制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。另取地龍對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。按照薄層色譜法[3]，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視[4]。3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖2。(實(shí)驗(yàn)條件：T 25 ℃，RH 65%)。

2.1.3 赤芍薄層鑒別 取補(bǔ)陽還五顆粒30 g，研細(xì)，加乙醇30 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液水浴加熱蒸干，殘?jiān)铀?0 ml微熱使溶解，用水飽和正丁醇20 ml/次，洗滌3次，合并正丁醇層溶液，蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。除赤芍外，取按處方比例的其他藥材，按照制備工藝制備顆粒，按上述制備供試品溶液方法制得陰性樣品溶液。另取赤芍對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。照薄層色譜法[3]，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃溫度下加熱至斑點(diǎn)清晰[5]。3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖3。(實(shí)驗(yàn)條件：T 25 ℃，RH 65%)。

圖2 地龍的薄層色譜鑒別

圖3 地龍的薄層色譜鑒別

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 C18色譜柱(Diamonsil，4.6 mm×200 mm,5 μm)；以乙腈-水(32∶68)作為流動相；檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；流速：1 ml/min。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不小于4 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.4 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，混勻，取適量，研細(xì)，取約15 g，精密稱定，精密加甲醇100 ml，加熱回流1 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 ml，微熱溶解，40 ml/次水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇層溶液，采用40 ml/次氨試液洗滌2次，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[6-8]。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)黃芪陰性顆粒，按上述供試品溶液制備方法制得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取黃芪陰性樣品溶液、供試品溶液和對照品溶液各20 μl，按照色譜條件進(jìn)行分析，測定結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，此法專屬性良好。

圖4 補(bǔ)陽還五顆粒液相色譜圖

注：A.陰性溶液色譜圖，B.黃芪甲苷對照品色譜圖，C.供試品色譜圖；1.黃芪甲苷

2.2.6 線性與范圍 精密吸取20 μl質(zhì)量濃度為50、100、200、400、800、1 600 μg/ml的對照品溶液，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量C(μg)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=1.490 8X+4.529，r=0.999 6。表明黃芪甲苷在50～1 600 μg/ml范圍與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μl，記錄峰面積，測得RSD為2.12%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和回收率試驗(yàn) 精密稱取補(bǔ)陽還五顆粒15 g，按上述供試品溶液制備方法處理，根據(jù)色譜條件，分別測定樣品放置0、2、4、6、8、12 h后黃芪甲苷的峰面積。測得RSD為2.26%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

精密稱取補(bǔ)陽還五顆粒15 g(n=6)，按上述供試品溶液制備方法，根據(jù)色譜條件，測定每份樣品中黃芪甲苷含量。結(jié)果表明，樣品中黃芪甲苷平均含量為0.242 6 mg/g，RSD為2.53%(n=6)，此法重復(fù)性良好。

精密稱取補(bǔ)陽還五顆粒7.5 g(n=6)，分別加入0.95 ml濃度為1.92 mg/ml的黃芪甲苷對照品溶液，按上述供試品溶液制備操作，測定樣品中含量，計算各樣品回收率，結(jié)果表明，黃芪甲苷平均回收率為101.01%，RSD為2.66%(n=6)，符合要求。結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品含量測定 取3批補(bǔ)陽還五顆粒樣品(批號：20180525、20180717、20180904)，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件依次操作分析，測定各自樣品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果3批樣品中黃芪甲苷的含量分別為0.233 4、0.223 2、0.247 2 mg/g。

表1 回收率試驗(yàn)

3 討論

3.1 補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)古代典籍中的經(jīng)典方，臨床長期應(yīng)用實(shí)踐療效確切。但湯劑需要臨用現(xiàn)制、煎煮耗時較長、不易保存、不便攜帶；而顆粒劑能夠提高中藥材的利用率，使劑量準(zhǔn)確、溶解迅速、便于吸收、起效快、無藥殘、口感好、攜帶保存方便、服用量小，故將補(bǔ)陽還五湯制成醫(yī)院顆粒制劑，除成型工藝外，其余與傳統(tǒng)湯劑基本一致，即以水為溶媒提取，以物理方法固液分離、濃縮、干燥、顆粒成型等工藝生產(chǎn)，使得中藥顆粒藥效物質(zhì)與中藥飲片水煎湯劑保持基本一致。同時又可根據(jù)辯證論治的原則，適當(dāng)配伍“單味中藥配方顆粒劑”，使之更符合病情的需要。

3.2 流動相選擇 筆者分別考察了乙腈-水(32∶68)、乙腈-水(33∶67)、乙腈-水(34∶66)。流動相為乙腈-水(34∶66)、乙腈-水(33∶67)時分離度<1.5，且有很多雜峰干擾。當(dāng)以乙腈-水(32∶68)為流動相時，峰形佳，分離度>1.5，表明黃芪甲苷分離效果較好，故選擇以乙腈-水(32∶68)為流動相[9-11]。赤芍薄層鑒別中，參考2015版《中國藥典》，展開劑含有三氯甲烷，而三氯甲烷毒性大，故選毒性較低的二氯甲烷，實(shí)驗(yàn)證明結(jié)果良好。