李曉倩，陳鳳收，張再莉，馬 虹

0 引言

脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)常見于術(shù)中需要短暫阻斷脊髓供應(yīng)血管的手術(shù)，如胸腹主動脈瘤手術(shù)、脊柱成形手術(shù)等，一旦出現(xiàn)可引起不同程度的、難以逆轉(zhuǎn)的運動和感覺功能異常，可造成巨大的經(jīng)濟和社會負擔[1]。SCIRI是多細胞交互聯(lián)系、多誘因、多種病理機制混雜的復(fù)雜的疾病過程[2]。隨著研究的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)是SCIRI發(fā)生后多種繼發(fā)性病理損傷急劇發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。缺血后處理(Ischemic post-conditioning，IPC)是在損傷早期使用機械阻斷血流到目標區(qū)域的一種人為干預(yù)措施，在動物缺血模型中已證實具有良好的神經(jīng)保護作用[5]。p53是一種最常見的應(yīng)激傳感效應(yīng)蛋白，既往針對IPC治療機制的研究中發(fā)現(xiàn)，IPC可以通過p53信號通路調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]。而鼠雙微粒體蛋白2(Murine double-minute 2，mdm2)是p53信號通路中重要的調(diào)控因子，可以與p53構(gòu)成降解-反式激活環(huán)路，從而恒定胞內(nèi)mdm2/p53比值，維持正常的細胞功能和活性[7-8]。在脊髓神經(jīng)元離體細胞實驗中，糖氧剝離可明顯下調(diào)mdm2水平，干擾兩者間的負反饋環(huán)路，使p53在核內(nèi)累積，引起胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。目前在SCIRI中，關(guān)于IPC能否通過p53-mdm2負反饋通路調(diào)節(jié)損傷脊髓中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究甚少，深入研究有助于探求新的臨床治療靶點。故本研究以IPC干預(yù)SCIRI模型大鼠，通過觀察大鼠后肢運動功能、對脊髓組織中氧化應(yīng)激代表性產(chǎn)物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的檢測，探討IPC的作用機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗p53多克隆抗體，兔抗mdm2單克隆抗體、GAPDH(武漢博士德)；MDA測定試劑盒(南京建成生物工程研究)、SOD測定試劑盒(上海放射免疫技術(shù)有限公司)；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天科技有限公司)；HIPAS-1000型圖像分析系統(tǒng)(武漢華海公司)；EIx800型酶標儀(美國BIO-TEK公司)。

1.2 實驗動物、分組和模型制備 雄性SD大鼠，8～10周齡，體重(200±20)g，購自中國醫(yī)科大學(xué)動物中心。12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)，實驗前后可自由進食水。采用隨機數(shù)碼表將60只大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、損傷組(IR組)和缺血后處理組(IPC組)，每組20只。參照文獻制備模型和IPC治療[2]。簡要過程如下：麻醉后，將大鼠右側(cè)臥位，通過頸胸口切口暴露主動脈弓，直視下將動脈夾夾至左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間，夾閉14 min誘導(dǎo)缺血，后撤除動脈夾誘導(dǎo)再灌注。Sham組僅暴露主動脈弓而不夾閉動脈夾。IPC組：在再灌注開始5 min后給予5個循環(huán)IPC(阻斷主動脈弓1 min/開放1 min為1個循環(huán))，其余步驟同IR組。所有大鼠均逐層縫合傷口，腹腔內(nèi)注射氨芐青霉素30 mg(0.3 ml)預(yù)防感染。

1.3 神經(jīng)功能評價 采用BBB評分測定脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況[3]。于術(shù)后12、24、36、48 h將大鼠放置于直徑為2米的圓形平臺上自由活動4 min，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動，定量評價損傷后的運動功能。評分分為3個部分：第1部分(0～7分)評判大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動情況；第2部分(8～13分)評判后肢的步態(tài)及前后肢協(xié)調(diào)功能，如是否可見爪掌面承重移動；第3部分(14～21分)評判運動中后肢后爪的精細動作，如是否可見持續(xù)性掌面移動、持續(xù)性爪抓地等。3項滿分為21分。

1.4 脊髓組織SOD和MDA含量測定 術(shù)后48 h，取L4-6節(jié)段脊髓組織，制成10%脊髓勻漿。低溫下以3 500 r/min的速度離心15 min，取上清進行組織蛋白定量。SOD采用黃嘌呤氧化酶法在532 nm波長下測定OD值；MDA采用硫代巴比妥酸法在550 nm波長下測定OD值。

1.5 Western blot測定大鼠脊髓組織中mdm2和p53蛋白表達 勻漿后測定蛋白質(zhì)樣品的濃度。每泳道上樣50 μg后，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h后，將膜加入兔抗mdm2多克隆抗體(1∶500)、兔抗p53單克隆抗體(1∶500)于4 ℃過夜，洗膜后繼續(xù)二抗室溫下孵育90 min。使用ECL試劑盒和HIPAS-1000型圖像分析系統(tǒng)記錄化學(xué)發(fā)光結(jié)果，以與GAPDH的比值作為表達強度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠損傷后脊髓神經(jīng)運動功能評價 術(shù)后各觀察點Sham組大鼠后肢運動和反射能力均無明顯異常。與Sham組相比，術(shù)后各觀察點(尤以24 h為著)，IR組大鼠BBB評分顯著降低，出現(xiàn)運動和反射能力下降(P<0.05)，但隨著時間延長略有所恢復(fù)；與IR組相比，IPC組各觀察點的BBB評分明顯升高，運動和反射能力有所恢復(fù)(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠損傷后脊髓組織中MDA和SOD含量的比較 與Sham組相比，IR組和IPC組術(shù)后各觀察點脊髓組織中MDA含量均明顯升高，而SOD含量明顯降低，尤以術(shù)后24 h變化最為明顯(P<0.05)；與IR組相比，IPC組各觀察點的MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高(P<0.05)。見表2、表3。

表1 SCIRI后48 h內(nèi)大鼠后肢BBB評分的變化

注：*與Sham組比較，P<0.05；#與IR組比較，P<0.05

表2 SCIRI后48 h內(nèi)大鼠脊髓組織中MDA含量的變化(nmol/mg)

注：*與Sham組比較，P<0.05；#與IR組比較，P<0.05

表3 SCIRI后48 h內(nèi)大鼠脊髓組織中SOD含量的變化(nU/mg)

注：*與Sham組比較，P<0.05；#與IR組比較，P<0.05

2.3 各組大鼠損傷后脊髓組織中mdm2和p53蛋白含量的比較 Western blot結(jié)果顯示，損傷后各觀察點，與Sham組比較，IR組脊髓組織中mdm2蛋白含量明顯下降、p53蛋白含量均明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，IPC組脊髓組織中mdm2蛋白含量明顯升高、p53蛋白含量明顯下降(P<0.05)。上述變化在術(shù)后24 h變化最為顯著。見圖1。

圖1 SCIRI后48 h內(nèi)大鼠脊髓組織中mdm2(A)和p53(B)含量的變化

3 討論

脊髓神經(jīng)細胞對缺血、缺氧等因素非常敏感，短暫的SCIRI即可引起廣泛的神經(jīng)損傷，出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的下肢運動和反射功能障礙。目前尚無有效的監(jiān)測和預(yù)防手段，因此，損傷后有效的治療至關(guān)重要。但SCIRI發(fā)生和發(fā)展的機制復(fù)雜，是涵蓋多因素、多機制的綜合性病理過程，目前仍無有效的治療方法。IPC最早發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用于心肌損傷過程中，通過在損傷早期及時給予幾個短暫的缺血-再灌注循環(huán)，進而降低心肌耗氧量、改善心肌代謝，獲得了良好的治療作用[9]。近年來，隨著對IPC不斷的探索和了解，IPC已逐漸應(yīng)用于肝、腎、腦等重要臟器中，有研究者提出在再灌注的早期給予IPC治療能獲得更好的效果[10]，因此，本研究在再灌注開始5 min即給予IPC治療，結(jié)果證實5個循環(huán)的IPC能夠明顯提高BBB評分，明顯改善大鼠后肢運動和反射能力。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是SCIRI進行性發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]，如何降低氧化應(yīng)激反應(yīng)是既往研究的熱點和靶點。Chen等[11]在大鼠大腦中動脈閉塞模型中，通過在再灌注后0、1、3 h分別給予肢體遠端缺血后處理，證實遠端缺血后處理在再灌注0 h可明顯減少NADPH氧化酶活化、降低髓過氧化物酶的含量、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，由于MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而SOD也是自身產(chǎn)生的氧自由基清除劑和抗氧化酶，所以除髓過氧化物酶之外，MDA和SOD被認為是另兩種代表性監(jiān)測氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標[5]。本研究中在損傷后各觀察點均發(fā)現(xiàn)受損脊髓組織中MDA含量明顯升高，而SOD含量明顯降低，提示SCIRI后體內(nèi)發(fā)生了進行性加重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，自身產(chǎn)生的SOD已不足以完全清除過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。而再灌注期早期(5 min)給予IPC治療明顯逆轉(zhuǎn)體內(nèi)MDA和SOD含量，提示IPC可通過加強自由基清除作用，阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)。

此外，既往對IPC保護機制的研究發(fā)現(xiàn)，IPC還可以針對應(yīng)激效應(yīng)蛋白p53和其下游的信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[6-7]。mdm2是p53的靶基因，可與p53形成負反饋環(huán)路，因此也是p53信號通路中最重要的調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，細胞內(nèi)的mdm2/p53比值相對保持穩(wěn)定，損傷后給予mdm2抑制劑(Nutlin-3)可顯著下調(diào)mdm2表達，從而阻斷p53泛素化降解、促進p53轉(zhuǎn)錄因子活性和p53介導(dǎo)的多種信號通路活化，最終導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥等多種病理損傷[7,12]。目前，在離體細胞實驗中已證實糖氧剝離可干擾脊髓神經(jīng)元內(nèi)p53和mdm2平衡，促進p53在核內(nèi)累積，引起神經(jīng)元發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[6]。針對負反饋環(huán)路，本研究也同樣發(fā)現(xiàn)IPC可通過增加mdm2的表達、抑制p53活性，改善大鼠后肢運動和反射功能。值得注意的是，mdm2是一種核蛋白，在癌細胞中給予Nutlin-3治療，也可明顯抑制p53-mdm2之間的相互作用，通過增強p53穩(wěn)定和胞內(nèi)聚集影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸[13]。綜上所述，IPC可以通過激活p53負反饋通路，在SCIRI中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，然而這僅僅是眾多保護機制中的一個環(huán)節(jié)，探尋能夠針對多因素綜合干預(yù)的藥物或方法才能獲得理想的治療效果。