李夢穎 ，張 瑞，楊 曄，2，邵福平，徐慧慧，尹登科，2，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所， 安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

格列喹酮作為第二代磺脲類口服降糖藥物，因口服吸收快、作用時間短的特點而在臨床上被廣泛使用，但是臨床上存在低血糖發(fā)生的風(fēng)險[1]。丹參因其活血化瘀、祛瘀止痛之功效常用于血瘀證[2]的治療。丹參注射液和格列喹酮在臨床上常用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療，但是丹參注射液對格列喹酮藥物代謝動力學(xué)參數(shù)是否有影響尚不清楚。本研究考察了丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)血藥濃度的影響，建立原位在體腸循環(huán)動物模型研究丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)腸吸收的影響，觀察丹參注射液對格列喹酮藥物代謝動力學(xué)參數(shù)及腸吸收特性的影響，為今后兩藥的臨床合用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 丹參注射液(批號 1705083)：上海中西制藥有限公司；格列喹酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號 D07F6J1)：上海源葉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ；批號 EZ2921B400)：美國Sigma公司；格列喹酮片(糖適平，批號 1140637)：北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；甲醇、乙腈(色譜純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為Mill-Q超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Hypersil BDS C18色譜柱：大連依利特公司；Wsters 1529高效液相色譜儀：美國Waters公司；220-A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZXZ-Z型循環(huán)水式真空泵：河南一恒儀器有限公司。

1.3 動物 健康SD大鼠20只，雌雄不限，SPF級，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～26 ℃，月齡1～2個月，體質(zhì)量(220±10)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2017-001；動物使用許可證號：SYXK(皖)2017-006]提供。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的制備 所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型復(fù)制前禁食12 h(一般過夜禁食，不禁水)，STZ按每千克體質(zhì)量65 mg的劑量一次性腹腔注射，臨用前用枸櫞酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.5)配制。72 h后檢測空腹血糖，空腹血糖濃度>16.6 mmol/L即為模型復(fù)制成功。

2.2 色譜條件 按照文獻(xiàn)[3]確定色譜條件。Hypersil BDS C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(65∶35)，過濾并脫氣；流速：1.0 mL/min；檢測波長：294 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 樣品的處理方法 精密吸取大鼠血漿200 μL，加入1 mL二氯甲烷，渦旋混勻2 min后，4 000 r/min離心10 min，取二氯甲烷層，50 ℃氮?dú)獯蹈桑?加入200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻2 min，12 000 r/min離心10 min后，取上清液20 μL進(jìn)樣。

精密吸取人工腸液樣品(Tyrode液)[4]200 μL，加入1 mL二氯甲烷，渦旋混勻2 min后，4 000 r/min離心10 min，取二氯甲烷層，50 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL流動相復(fù)溶，渦旋混勻2 min，12 000 r/min 離心10 min 后，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.4 藥物代謝動力學(xué)研究 選取12只糖尿病大鼠，隨機(jī)分為格列喹酮組和丹參-格列喹酮組。格列喹酮組單獨(dú)灌胃給予15 mg/kg(按照人與大鼠等效劑量比值6倍換算，相當(dāng)于藥品說明書建議成人每日臨床劑量 2.5 mg/kg)的格列喹酮混懸水溶液；丹參-格列喹酮組先腹腔注射2 mL/kg(藥品說明書建議成人每日臨床劑量0.5 g/kg)的丹參注射液5 min后，灌胃給予15 mg/kg的格列喹酮混懸水溶液。兩組均在給予格列喹酮后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8 h經(jīng)眼眶取血0.3 mL血樣，所取血樣分別置于1.5 mL涂有肝素鈉的微型離心管中，靜置30 min后，在4 000 r/min下離心10 min，取上層血漿200 μL，按“2.3”項下操作，記錄峰面積，計算血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時間曲線圖。

2.5 腸吸收實驗 按文獻(xiàn)[5]的方法，將糖尿病SD大鼠(禁食12 h、自由飲水)隨機(jī)分為兩組(格列喹酮組和丹參-格列喹酮組)，每組4只，稱質(zhì)量后腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，麻醉后固定并維持體溫，沿腹中線打開腹腔，暴露小腸，兩組大鼠均選取全腸段(選取腸段標(biāo)準(zhǔn)如下：十二指腸自幽門1 cm處開始向下，盲腸上行10 cm止)，腸段兩端切口，用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，切口兩端分別插管，結(jié)扎固定。傷口處用浸有生理鹽水脫脂棉覆蓋保濕，保溫37 ℃。以10 μg/mL格列喹酮-Tyrode灌注液40 mL進(jìn)行腸循環(huán)灌注，流速為0.2 mL/min，待灌注液充滿整個循環(huán)通路時記為0時刻，循環(huán)灌注180 min后結(jié)束，期間每隔20 min取循環(huán)液1 mL并檢測其中格列喹酮含量。丹參-格列喹酮組在10 μg/mL格列喹酮-Tyrode液灌注前5 min，經(jīng)尾靜脈注射丹參注射液(2 mL/kg)，再按上述方法進(jìn)行實驗，兩組均設(shè)置空白大鼠對照。實驗結(jié)束后測定小腸剩余藥量x，根據(jù)小腸剩余藥量的對數(shù)(lnx)對取樣時間t作圖，求得速率常數(shù)(rate constant，Ka)，計算表觀滲透系數(shù)(apparent permeablility coefficient， Papp)。計算公式如下[4-5]：

lnx=lnx0-Kat

其中x0為灌注液中的藥物初始量，A為小腸吸收面積。

3 結(jié)果

3.1 丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)血藥濃度的影響 格列喹酮單獨(dú)灌胃以及與丹參注射液合用后其藥物代謝動力學(xué)過程在糖尿病大鼠體內(nèi)均符合一室模型。藥-時曲線見圖1，藥物代謝動力學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果表明，在與丹參注射液合用后，格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)發(fā)生了顯著的改變。達(dá)峰時間從2.70 h縮短到了2.08 h；最大藥物濃度從6.35 μg/mL增加到了24.14 μg/mL，大約提高了3.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥-時曲線下面積從37.35 mg/(L·h)提高至89.42 mg/(L·h)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；并且清除率大約縮小了2倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)

3.2 丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠腸內(nèi)吸收的影響 丹參注射液對格列喹酮腸吸收特性見表2。與格列喹酮組相比，丹參-格列喹酮組的吸收速率Ka從(8.53±1.29)×10-3/s增加到(21.39±7.47)×10-3/s；Papp從(1.82±0.22)×10-8cm/s增加到(4.35±1.35)×10-8cm/s；丹參-格列喹酮組的Ka和Papp值顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明丹參注射液可以促進(jìn)格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)的吸收。

4 討論

格列喹酮與丹參注射液合用后能顯著增加格列喹酮的cmax、AUC，顯著縮短tmax，顯著減少Cl。丹參注射液可以顯著增加格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)的Ka和Papp。這可能是丹參中某些成分影響格列喹酮的吸收、分布、代謝和排泄過程。腸道外排載體和血流速度可能是影響藥物口服吸收的因素。有研究表明，丹參酮Ⅰ為丹參的有效成分之一，可以抑制以地高辛為底物的P-糖蛋白(P-glyocprotein，P-gp)轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。筆者推測，丹參中某些成分可能通過抑制P-gp而影響格列喹酮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。丹參具有活血的作用，丹參的主要成分丹參酮ⅡA能通過抑制一氧化氮合成酶和提高細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)物，引起血管的舒張，從而加快血液流動[9]，丹參素A和隱丹參酮以及二氫丹參酮同樣有著擴(kuò)張血管的作用[10]，擴(kuò)張血管、加快血液流動可能是丹參注射劑影響格列喹酮腸道吸收的原因之一。格列喹酮在大鼠和人的體內(nèi)主要由CYP2C系列的肝藥酶代謝，其他涉及的酶還有CYP3A、CYP2D、CYP1A和CYP2E系列的酶[11-12]。而丹參中活性成分隱丹參酮不僅可以競爭性抑制肝微粒體的CYP1A2和CYP2C9，還可以非競爭性地抑制CYP3A4酶的活性；丹參酮可以抑制肝藥酶CYP1A2、CYP2C6和CYP2C11的活性，并且丹參酮ⅡA可顯著抑制CYP2C19的活性[13-14]；丹參的乙醇提取物是CYP1A2 酶的強(qiáng)抑制劑，是CYP3A4/5的中等強(qiáng)度抑制劑[15]。因此，丹參可能通過抑制一個或多個肝微粒體酶，從而抑制格列喹酮在肝臟內(nèi)的代謝，進(jìn)而影響格列喹酮在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，改變其藥物代謝動力學(xué)過程。

表1 丹參注射液對格列喹酮藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響

注：與格列喹酮組相比，*P<0.05；t1/2(half-life)：半衰期；tmax(time to peak)：達(dá)峰時間；cmax(peak concentration)：最大血藥濃度；Cl(clearance)：清除率；AUC(area under curve)：血藥濃度-時間曲線下面積

表2 丹參注射液對格列喹酮在糖尿病大鼠體內(nèi)腸吸收特性的影響

注：與格列喹酮組比較，*P<0.05

綜上所述，丹參注射液和格列喹酮合用可以顯著提高糖尿病大鼠格列喹酮的血藥濃度和生物利用度，其原因可能與丹參注射液促進(jìn)格列喹酮的小腸吸收相關(guān)，提示臨床上丹參注射液與格列喹酮聯(lián)合用藥時格列喹酮用量需適當(dāng)調(diào)整，以免發(fā)生不良反應(yīng)。