張 黎 劉萍丹 張艷朵 鄭龍龍

1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，山西太谷 030801；2.云南省文山壯族苗族自治州廣南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村和科學(xué)技術(shù)局，云南廣南 663300；3.云南省文山壯族苗族自治州廣南縣者兔鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，云南廣南 663300

豬鏈球菌廣泛存在于豬的上呼吸道、消化道和生殖道，該菌可在無臨床癥狀的情況下定殖。豬鏈球菌病在臨床上主要分為腦炎型、敗血型、關(guān)節(jié)型和淋巴結(jié)炎型，其中敗血型鏈球菌病發(fā)病最急，死亡率最高，危害最為嚴(yán)重[1-2]。豬敗血型鏈球菌病一年四季都可感染，其來勢猛、病程短、死亡率高，患病豬皮膚發(fā)紅，脾臟腫大，與非洲豬瘟臨床癥狀部分相似[3]，給養(yǎng)殖戶造成巨大心理恐慌。因此，在臨床中需要根據(jù)當(dāng)?shù)厮幬锩舾行赃x擇合適的藥物配合疫苗免疫進(jìn)行防控。本研究通過分離和鑒定云南廣南縣部分規(guī)模化豬場發(fā)病豬的致病細(xì)菌，并對分離株進(jìn)行敏感藥物性篩選，為云南廣南縣規(guī)?；i場發(fā)生敗血型鏈球菌的臨床用藥提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年3月至5月采集來自云南省廣南縣20個規(guī)?；B(yǎng)殖場出現(xiàn)急性死亡，臨床上呈現(xiàn)敗血型、神經(jīng)癥狀的豬肺臟20份，立即分離培養(yǎng)細(xì)菌。

1.2 試驗材料

MH藥敏培養(yǎng)基、葡萄糖肉湯、麥?zhǔn)媳葷峁?、藥敏紙片等，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實驗室提供。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鏡檢

按照常規(guī)細(xì)菌分離方法，將病料接種于葡萄糖肉湯中增菌12 h，取1.5 mL菌液1 000 r/min離心5 min后，棄去1 mL，混勻后取100 μL涂布于綿羊血瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落作純培養(yǎng)后備用。

將可疑菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 藥敏試驗

將分離菌株接種到營養(yǎng)肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)12 h后，使用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度到1.5×108個/mL。按常規(guī)細(xì)菌接種方法取菌液100 μL均勻涂抹在MH藥敏培養(yǎng)基上，并貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片（直徑6 mm），在4℃環(huán)境中放置30 min。然后再移入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑后，判定依據(jù)參考美國《臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性

病料經(jīng)肉湯擴菌后接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，在瓊脂平板上長出細(xì)小菌落，血瓊脂平板上生長的菌落為細(xì)小、灰白色、濕潤、隆起呈半透明狀，菌落周圍有明顯的β溶血環(huán)，界限分明、完全透明的溶血環(huán)。

取菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，可見成對或短鏈狀排列的革蘭氏陽性鏈球菌。

2.2 藥敏試驗

取上述分離菌按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果該分離菌對磷霉素鈉、恩諾沙星、阿莫西林、大觀霉素高度敏感，對β-內(nèi)酰胺類（第三代頭孢類藥物頭孢曲松、頭孢噻肟、氨芐西林）、截短側(cè)耳素類（泰妙菌素）、氨基糖苷類（新霉素）、四環(huán)素類（土霉素、強力霉素）、氯霉素類（氟苯尼考）等藥物產(chǎn)生耐藥性（表1）。

表1 分離菌對臨床常用藥物的敏感性

3 討論

豬鏈球菌已成為規(guī)?；B(yǎng)豬場常見的高度傳染性病原菌，其中敗血型鏈球菌病死率較高，是危害最為嚴(yán)重的鏈球菌之一，可以通過多種渠道感染不同日齡豬群，常與豬圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、巴氏桿菌混合感染[4-6]。因此，單獨使用市場上常見的疫苗進(jìn)行預(yù)防效果欠佳。目前普遍采用多種抗生素綜合防控敗血型鏈球菌。因此，選擇合適的藥物顯得尤為重要。

敗血型鏈球菌的病原群、臨床癥狀、感染對象和耐藥性均趨于嚴(yán)重化[7-10]，阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。豬鏈球菌最初被劃分為35個血清型[11-14]，每種血清型都含有較多序列類型，不同的鏈球菌感染在基因序列、血清、臨床癥狀、人畜共患性和流行潛力等方面具有特異性，導(dǎo)致難以研發(fā)通用型疫苗防治不同類型的豬鏈球菌感染[15-16]，因此迫切需要選擇敏感藥物對其進(jìn)行控制。

磷霉素能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性，并抑制其合成；同時，其還有利于其他藥物進(jìn)入菌體，以不同的機制殺滅細(xì)菌。磷霉素與其他藥物無交叉耐藥性，可以與多種藥物發(fā)揮協(xié)同作用，如與頭孢哌酮、亞胺培南等聯(lián)用對甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌臨床分離株的ED50和MIC降低至原來的十分之一至幾十分之一[17-19]。

本研究對分離獲得的病原菌株進(jìn)行了7類12種抗生素的藥物敏感性分析，結(jié)果顯示致病性鏈球菌對磷霉素鈉、恩諾沙星、阿莫西林、大觀霉素敏感，對β-內(nèi)酰胺類氨芐西林、阿莫西林、氨基糖苷類新霉素、四環(huán)素類土霉素、強力霉素、氯霉素類氟苯尼考產(chǎn)生耐藥性，呈現(xiàn)出多重耐藥性。