李 志，邢 宇,b，房克鳳，曹慶芹，秦 嶺,b，張 卿,b*

(北京農(nóng)學(xué)院 a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，b.北京林果業(yè)生態(tài)功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心,c.園林學(xué)院，d.生物與資源環(huán)境學(xué)院，北京 102206)

板栗為殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，是兼具生態(tài)和經(jīng)濟價值的特色經(jīng)濟林樹種，其堅果中淀粉含量占干物質(zhì)的46%～64%[1]，被稱為“鐵桿莊稼”，自古就是重要的木本糧食。中國板栗資源豐富，在全國26個省、市、自治區(qū)均有栽培。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)統(tǒng)計，2016年中國板栗栽培面積為32.6萬hm2，總產(chǎn)量187.9萬t，分別占世界的54.1%和83.2%，均居世界第一。近年來，中國山區(qū)板栗平均不足1.5 t/hm2，產(chǎn)量低已經(jīng)成為限制板栗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。眾所周知，板栗產(chǎn)量形成和品質(zhì)調(diào)控的過程是淀粉積累的過程，因此，板栗淀粉積累的分子機理研究一直是關(guān)注的重點。然而，有關(guān)板栗淀粉積累分子機理研究的報道相對較少。鑒定并克隆出板栗淀粉分支酶基因CmSBE的全長，并發(fā)現(xiàn)CmSBE主要參與調(diào)控板栗支鏈淀粉的生物合成[2-3]；王猛等克隆出板栗堅果顆粒淀粉結(jié)合酶基因GBSS全長并進行相關(guān)生物信息學(xué)分析[4]。板栗淀粉積累的分子機理研究相對較少的主要原因之一可能是板栗相關(guān)基因的功能驗證體系仍不完善。目前，僅在美洲栗和歐洲栗中初步建立胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化體系[5-6]，而且該技術(shù)體系存在一定缺陷：胚性愈傷組織誘導(dǎo)困難、數(shù)量少、周期長，限制栗屬植物重要基因功能的驗證。板栗體細胞胚可誘導(dǎo)大量的非胚性愈傷組織，利用非胚性愈傷組織在細胞水平上開展淀粉代謝及調(diào)控的分子機理研究?；诖耍驹囼炌ㄟ^轉(zhuǎn)化紅色標志基因DsRed建立板栗非胚性愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)體系并進行優(yōu)化研究，為今后開展板栗淀粉和糖代謝相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

板栗非胚性愈傷組織由采自北京市懷柔區(qū)板栗實驗站的‘燕山紅栗’(Castaneamollissima‘Yanshanhongli’)幼胚根尖誘導(dǎo)。菌株為GV3101，購自上海唯地公司。載體為Gateway系統(tǒng)的植物RNAi沉默載體277，為北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室保存。質(zhì)粒攜帶標記基因DsRed，其表達產(chǎn)物為紅色熒光蛋白。

1.2 試驗方法

1.2.1 板栗非胚性愈傷組織誘導(dǎo) 參考Lu等的誘導(dǎo)方法并稍做改進[7]。采集板栗花后60 d的堅果，消毒后用無菌蒸餾水沖洗，分離出幼胚根尖，將其置于E1培養(yǎng)基(Embryo initiation medium，E1)中，在黑暗中連續(xù)培養(yǎng)56 d以上，直至板栗非胚性愈傷組織形成。

1.2.2 板栗非胚性愈傷組織侵染方法及優(yōu)化 參考美洲栗轉(zhuǎn)化方法[8]。將帶有DsRed基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，在液體Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)中培養(yǎng)，離心，棄上清，將沉淀溶于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，侵染板栗非胚性愈傷組織，并進行超聲波處理，然后在垂直混合儀中共培養(yǎng)。取出非胚性愈傷組織，盡量除去菌液，轉(zhuǎn)移到含有無菌濾紙的培養(yǎng)皿，繼續(xù)暗培養(yǎng)。將板栗非胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到帶有特美汀和頭孢噻污抗生素的固體培養(yǎng)基上，平鋪成近似橢圓形，再次進行暗培養(yǎng)。共培養(yǎng)7 d后，在體式熒光顯微鏡(蔡司公司，Discovery.V20)下進行觀察。

文獻顯示，影響遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因子主要有菌液濃度[9]、超聲處理時間[10]、共培養(yǎng)時間[11]、干燥時間[12]等，因此，針對這四個因子設(shè)計四因素五水平正交試驗，探索侵染效率最高的最優(yōu)組合。

本試驗通過設(shè)計L25(54)正交試驗對轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因素，即菌液濃度(A)、超聲處理時間(B)、共培養(yǎng)時間(C)、干燥時間(D)進行優(yōu)化，每次試驗3個重復(fù)，見表1。

表1 板栗愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化正交試驗因素水平Tab.1 Transient transformation orthogonal test factors levels in chestnut callus

1.2.3 侵染效率分析方法 利用體視熒光顯微鏡對每個試驗處理隨機選取3個板栗非胚性愈傷組織細胞團進行拍照，利用imageJ軟件分析熒光強度并計算平均值，用熒光強度代表侵染效率進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗非胚性愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

經(jīng)過56 d的誘導(dǎo)，外植體成功誘導(dǎo)為板栗非胚性愈傷組織，并進行繼代培養(yǎng)。板栗非胚性愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中為白色，外表緊湊，形狀不規(guī)則，見圖1。

圖1 板栗非胚性愈傷組織Fig.1 Chestnut non-embryonic callus

2.2 非胚性愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化方法建立

板栗非胚性愈傷組織共培養(yǎng)7 d后，即可在體視熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光，表明成功將帶有DsRed基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入板栗非胚性愈傷組織細胞并正常表達，見圖2。

圖2 板栗非胚性愈傷組織DsRed基因表達Fig.2 Expression of DsRed gene in chestnut non-embryonic callus注：A1為熒光體視顯微鏡眀場下的非胚性愈傷組織；A2為在熒光體視顯微鏡綠光下與A1相同的非胚性愈傷組織；B1為熒光體視顯微鏡眀場下未經(jīng)任何處理的板栗非胚性愈傷組織；B2為熒光體視顯微鏡綠光下未經(jīng)任何處理的與B1相同的板栗非胚性愈傷組織。Note: A1.Transformed non-embryonic callus observed under white light; A2. The same non-embryonic callus showed in A1 observed under green light showing red fluorescence; B1. Non-embryonic callus without any treatment observed under white light; B2. The same non-embryonic callus showed in B1 observed under green light showing red fluorescence.

2.3 非胚性愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化方法優(yōu)化

板栗非胚性愈傷組織在不同試驗組合處理下，瞬時轉(zhuǎn)化DsRed基因發(fā)出的紅色熒光強度見表2。k1-k5是1-5水平試驗熒光強度的平均值，其中最大值代表的水平即為該因素的最優(yōu)水平；R是k1-k5的極差，R值越大，表明該因素對于試驗結(jié)果的影響程度越大。

表2 板栗愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化正交試驗結(jié)果Tab.2 Transient transformation orthogonal test results of chestnut callus

由表2可知，在菌液濃度(A)各個水平中，k3水平最大，達到了35.205，表明菌液OD600為1.5時侵染效率最高；超聲時間(B)為k4水平時，共培養(yǎng)時間(C)為k1水平時和干燥時間(D)為k4水平時，板栗非胚性愈傷組織的侵染轉(zhuǎn)化效率最高。板栗非胚性愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化體系的最優(yōu)條件為A3B4C1D4，即菌液為OD600=1.5，超聲時間為90 s，共培養(yǎng)時間為1 h，干燥時間為3 d。同時，從表2可知，菌液濃度R值為19.489，共培養(yǎng)時間R值為13.562，干燥時間和超聲時間R值小于10，說明菌液濃度對非胚性愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化效率的影響最大。

3 討 論

在美洲栗和歐洲栗中，Corredoira等和Newhouse等分別利用胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系將編碼幾丁質(zhì)酶的內(nèi)源性CsCh3基因和OxO基因轉(zhuǎn)化到歐洲栗和美洲栗中，并獲得穩(wěn)定的遺傳表型[6,8]。在體細胞胚再生體系中，Lu等人發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低，板栗胚珠的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率僅為28.22%[7]；胚性愈傷組織的不同發(fā)育階段需要更換不同種類的培養(yǎng)基(E1-E4)，操作比較復(fù)雜；該轉(zhuǎn)化體系試驗周期長，即使是相對成熟的美洲栗胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系，至少需要培養(yǎng)42 d才能觀察到表型。這些問題限制栗屬植物基因功能的研究。本試驗建立的板栗非胚性愈傷瞬時轉(zhuǎn)化體系能夠滿足細胞水平上開展淀粉和糖類代謝及其分子調(diào)控機理研究的需求。非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較高(49.81%)，操作簡單，而且共培養(yǎng)7 d后在細胞水平進行表型驗證。該體系是一種簡單、快速、高效的基因驗證體系，為在細胞水平上開展物質(zhì)代謝及其分子調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。