何 軍

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

金銀花，又名忍冬(FlosLonicerajaponica)，忍冬科忍冬屬多年生半常綠纏繞及匍匐莖的灌木，我國常用大宗中藥材[1-2]。從其植株中分離出有機(jī)酸[3]、黃酮[4]、揮發(fā)油[5]、多糖[6]等200多種化學(xué)成分[7]，除綠原酸之外，黃酮類化合物也是其主要有效成分之一，具有顯著的抗氧化作用[8-12]，在臨床上有保肝利膽、抗腫瘤、降血糖血脂的功效[13-14]，因此黃酮含量的高低也是評判金銀花質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[15]。

金銀花在商洛山區(qū)的分布十分廣泛，種植面積逐年擴(kuò)大，自2008年以來，以商州、鎮(zhèn)安、柞水、山陽、丹鳳為中心，在南北山區(qū)的800～1200 m區(qū)域的山坡地帶集中建立了金銀花基地13333.3 hm2，其中建立野生撫育基地6666.7 hm2。金銀花在商洛的收購量占到全省總收購量的50%以上[16]，是陜西省金銀花的第一主產(chǎn)區(qū)，它包括金銀花在內(nèi)的“商藥”品牌正在成為商洛的一張名片，正在扮靚商洛中藥產(chǎn)業(yè)，并輻射帶動整個陜南地區(qū)及毗鄰省區(qū)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展仍然以種植業(yè)為主，產(chǎn)品加工處于初級形態(tài)，工業(yè)規(guī)模小，加工工藝落后，商業(yè)也很薄弱，整個產(chǎn)業(yè)頭重腳輕，發(fā)展極不平衡，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)刂兴幃a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鑒于此，本文以商洛市金銀花為材料，在傳統(tǒng)醇提取法的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助處理，提取其有效成分，探索出一條既經(jīng)濟(jì)、高效，又適合商洛當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的提取工藝，以期為商洛當(dāng)?shù)亟疸y花資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金銀花(購于商洛市洛南縣麻坪鎮(zhèn)陳臺村8組)，將其放于60 ℃恒溫干燥箱進(jìn)行烘干，除雜，粉碎，過60目國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，之后各用密封袋包裝并置于干燥器內(nèi)備用。

1.2 試驗試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品HPLC≥99%(成都埃法生物有限公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇，均為分析純。所用水均為去離子水。

1.3 儀器設(shè)備

多功能中草藥粉碎機(jī)(750T)，低溫高速離心機(jī)(TDL-5A)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(101型)，電子精密天平(FA1104)，超聲波處理器(KQ5200E)，紫外可見分光光度計(UV-1780)。

1.4 試驗方法

1.4.1 提取工藝 傳統(tǒng)方法有水提法[17]、醇提法等[18-19]，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新型提取方法，如微波輔助提取法[20-21]、超聲波法[22]、超臨界流體萃取技術(shù)等[23-25]。

在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本試驗采用超聲波法輔助提取的工藝，其流程為：金銀花→干燥→粉碎→超聲輔助提取→離心(4000 r/min)20 min→取一定量上清液→稀釋一定倍數(shù)→亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法→測定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密儀器準(zhǔn)確稱取經(jīng)充分干燥的蘆丁粉末5.0 mg，用75%乙醇溫水浴中溶解后，移至25 mL容量瓶中定容至刻度，即為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液搖勻備用。準(zhǔn)確量取0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL的容量瓶中，各加入1 mL的5% NaNO2溶液混勻，6 min后各加入1 mL的10% Al(NO3)3混勻放置6 min，再加入10 mL的4.3% NaOH溶液，75%乙醇定容搖勻，放置15 min，以空白液為對照，在510 nm波長下測定各濃度標(biāo)樣的吸光度。以吸光度A作為縱坐標(biāo)，以總黃酮的濃度C作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 黃酮含量測定方法 本試驗參照汪秀妹[26]采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定金銀花總黃酮含量。將試樣液稀釋10倍，移取6 mL于25 mL容量瓶中，按照其2.2.1章節(jié)所敘述的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測定其吸光值，通過回歸方程計算各樣品中黃酮的含量。再按下式計算總黃酮的提取率。

X=(C×V×F)/(m×1000000)

式中：X為樣品中黃酮類化合物含量(%)，C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出被測液中黃酮濃度(μg/mL)，m為樣品的質(zhì)量(g)，F(xiàn)為稀釋倍數(shù)，V為待測液的總體積(mL)。

1.4.4 單因素試驗 本試驗采用超聲波輔助乙醇法提取金銀花總黃酮，在參照文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)，影響金銀花得率的因素有超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時間等，本研究選擇了超聲提取溫度、乙醇濃度、料液比、超聲提取時間作為主要影響因子，研究它們對金銀花總黃酮得率的影響。單因素試驗設(shè)計如下：

超聲溫度：35、45、55、65、75 ℃；乙醇濃度：25%、40%、55%、70%、85%；料液比(m/v,g/mL)：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；超聲時間：30、40、50、60、70 min。

1.4.5 正交試驗研究 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，在每個因素里面選擇對金銀花中總黃酮提取率影響較大的3個水平，設(shè)計L9(34)正交試驗，以商洛金銀花總黃酮的提取率為檢測指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)試驗測定結(jié)果，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=11.546x-0.0845 (R2=0.9996)，其中y值為吸光度(Abs)，x值為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素研究

2.2.1 不同超聲提取溫度對金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取超聲溫度為35、45、55、65、75 ℃，乙醇濃度55%，料液比1∶20，超聲浸提時間為30 min。超聲溫度對黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同超聲提取溫度對金銀花總黃酮提取的影響

由圖2可知，總黃酮提取率最高為1.81%，黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，所以它本身容易在高溫下氧化。當(dāng)溫度在45～65 ℃時，得到的黃酮提取率為最高。一旦超過55 ℃，黃酮的提取率就會下降，這可能是因為在高溫下部分黃酮被氧化了。故選超聲溫度45、55、65 ℃進(jìn)行正交試驗分析。

2.2.2 不同乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取乙醇濃度25%、40%、55%、70%、85%，以1∶20的料液比，在55 ℃下超聲浸提30 min。乙醇濃度對金銀花總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 不同乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響

由圖3可知,隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也相應(yīng)提高，得到的最大值為1.39%，但乙醇濃度超過55%后，黃酮的提取率反而降低。這可能是因為某些黃酮類物質(zhì)的溶出被高濃度的乙醇限制了。故選乙醇濃度40%、55%、70%、進(jìn)行正交試驗分析。

2.2.3 不同料液比對金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花粉末5.0 g，選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，乙醇濃度55%，在55 ℃下超聲浸提30 min。料液比對金銀花總黃酮提取率的影響見圖4。

以乙醇為溶劑提取時，適當(dāng)加大料液比，可將更多的被提取物質(zhì)提取出來。由圖4可知，用乙醇提取金銀花中總黃酮時，黃酮提取率會隨著隨著料液比的加大而加大，但當(dāng)料液比超過1∶30時，黃酮的提取率增加不大，金銀花黃酮最大提取率為1.72%。故選料液比1∶20、1∶30、1∶40進(jìn)行正交試驗分析。

圖4 不同料液比對金銀花總黃酮提取的影響

2.2.4 不同提取時間對金銀花總黃酮提取的影響 精確稱量金銀花樣品5.0 g，選取超聲時間30、40、50、60、70 min，乙醇濃度55%，料液比1∶40，超聲溫度55 ℃。提取時間對金銀花總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 不同提取時間對金銀花總黃酮提取的影響

由圖5可知，隨著溶劑在金銀花中慢慢地滲入，黃酮類化合物溶于乙醇溶液而被提取出來。如果增加適當(dāng)?shù)慕釙r間，可使提取物質(zhì)被更多地溶出。由圖5可知，當(dāng)提取時間為40～50 min時，黃酮的提取率最高達(dá)到1.59%；提取時間一旦超過50 min時，由于黃酮長時間在55 ℃的溫度下暴露，部分黃酮可能就會被氧化，從而導(dǎo)致其提取率降低。故選40、50、60 min進(jìn)行正交試驗分析。

2.3 正交試驗研究

2.3.1 因素與水平的確定 基于上述單因素試驗結(jié)果，確定以乙醇濃度(%)、超聲時間(min)、超聲溫度(℃)、料液比4個對金銀花超聲波法提取工藝影響的因素作為考察對象，以總黃酮得率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗，因素與水平見表1。

表1 單因素與水平

2.3.2 正交試驗分析 制備9份樣品，分別按表1進(jìn)行正交試驗設(shè)計，以黃酮提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，極差最大的是A因素，其次為C因素、B因素，極差最小的是D因素，說明從金銀花超聲波輔助乙醇法提取總黃酮對含量影響最大的因素為超聲提取溫度，其次為料液比和乙醇濃度，提取時間的影響最小。

表2 正交試驗直觀分析表

2.3.3 正交試驗方差分析 商洛市金銀花超聲輔助法提取總黃酮正交試驗方差分析結(jié)果見表3。從金銀花超聲波輔助提取總黃酮的正交試驗方差分析結(jié)果可以看出(表4)，A因素(F0.05

表3 黃酮含量方差分析表

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本文以乙醇為溶劑，利用超聲輔助法提取商洛市金銀花中總黃酮，在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗分析，得出商洛市金銀花中綠原酸最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、超聲時間40 min、超聲溫度45 ℃、料液比1∶30，黃酮的提取率可達(dá)2.66%。

3.2 討論

以正交試驗結(jié)果為依據(jù)，參照最佳工藝參數(shù)對金銀花總黃酮進(jìn)行了提取，重復(fù)3次，得到金銀花總黃酮提取率約為2.66%，與梁萱等[27]工藝相比較得率(1.1118%)較高；與賈霖等[28]用乙醇回流法提取金銀花黃酮相比，使用超聲波輔助法提取金銀花黃酮顯然有著操作簡便、設(shè)備簡易、綠色經(jīng)濟(jì)特點；比起黃小梅等[29]用超聲波提取金銀花黃酮的提取時間(2 h)足足縮短了80 min，故做到了節(jié)省時間；李曉軍[30]所用溫度80 ℃，與之相比溫度較適中(45 ℃)，有效成分穩(wěn)定、不易分解，效率較高。

因此本試驗提出的新工藝具有綜合成本低、污染較小、工藝簡易、提取效率較高的特點，并且在實際操作中發(fā)現(xiàn)工藝非常穩(wěn)定、重現(xiàn)性很好，可以為當(dāng)?shù)亟疸y花資源的可持續(xù)利用提供借鑒。除上述之外，超聲輔助法還可以有效地克服傳統(tǒng)煎煮法提取中藥材細(xì)粉易糊化、堵塞等問題。