賴隆永，劉友霖，劉小龍，譚禮寧，吳昌標，楊 慧，余勛信，楊守深，徐 磊,5*

(1.派生特(福州)生物科技有限公司，福建 福州 350500；2.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，福建 福州 350303；3.福建生物工程職業(yè)技術學院，福建 福州 350007；4.龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；5.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京 211102)

在抗生素大量使用的今天，細菌對抗生素產(chǎn)生的廣泛耐藥性以及由此造成的環(huán)境污染，已經(jīng)對人們的健康構成了威脅[1]。因而尋找和開發(fā)新一代抗菌藥物是當今研究的熱點，豬源抗菌肽已成為人們關注的焦點之一[2]。目前已經(jīng)從豬體內發(fā)現(xiàn)了12種以上不同的豬源抗菌肽，包括，PR-39、PMAP-23和NK-lysin等，這些豬源抗菌肽對多種微生物有廣譜殺菌作用。其中，NK-lysin可以直接結合脂多糖的類脂部分，可抗各種細菌、真菌如大腸桿菌、巨大型芽孢桿菌、乙酸鈣不動桿菌等，甚至還可以溶解一些腫瘤細胞[3]。NK-lysin的抗微生物和溶解腫瘤活性被認為是由于它具有脂質作用，其兩親性與螺旋結構在細胞膜上形成孔道，完整的二硫鍵對于其抗微生物活性是必需的[4]。

豬源抗菌肽NK-lysin是一種由細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生的抗菌肽[5]，已經(jīng)在多種生物體中鑒定出豬源抗菌肽NK-lysin相似物，其中一些生物體具有抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的抗菌活性[6,7]。楊霞等[8]研究表明合成綿羊抗菌肽NK-lysin對大腸桿菌、沙門氏菌具有抑制活性，在治療雛雞沙門氏菌攻毒的過程中能夠明顯降低死亡率，對雛雞心臟、肝臟、腎臟的病理損傷也明顯小于對照組。然而，豬源抗菌肽NK-lysin(78個殘基)的片段長度使得化學合成或生物合成變得困難[9]。閆潔熙以哺乳動物NK-lysin為模板進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)NK-lysin通過破壞癌細胞的細胞膜完整性對包括耐藥癌細胞在內的一系列癌細胞表現(xiàn)出較高的抗癌活性；同時，NK-lysin通過擾動細菌外壁、干擾細胞質膜并與細菌細胞質內DNA相結合的雙重作用機制發(fā)揮抗菌活性，能夠迅速并劑量依賴性地抑制和殺死革蘭氏陰性菌/革蘭氏陽性菌[10]。

在抗生素使用日益嚴重的形勢下[11-13]，豬源抗菌肽的價值和前景顯而易見。然而豬源抗菌肽在小鼠體內的抑菌效果尚不明確，在化學合成上出現(xiàn)了很多的問題。本文以小鼠為研究對象，通過對其腹腔注射豬源抗菌肽和大腸桿菌，觀察小鼠對大腸桿菌的免疫預防和治療效果，并PCR擴增、測序得到豬源抗菌肽NK-lysin的基因序列，對豬源抗菌肽NK-lysin的理化性質和蛋白結構進行分析，加強了豬源抗菌肽的基礎性研究和生物學功能與作用機制等方面的研究，對開發(fā)與利用豬源抗菌肽具有重要的意義。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

豬源抗菌肽，多肽含量不低于300 μg/mL，由派生特(福州)生物科技有限公司按照已授權國家發(fā)明專利[14]制備；大腸桿菌(ATCC 25922)由龍巖學院楊守深博士饋贈；7日齡昆明小鼠，購自吳氏實驗動物。

1.2 主要試劑

麥康凱培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)、PCR 試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、DL2000 DNA Maker(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京康為世紀生物科技有限)、利福平(Sigma公司)等。

1.3 主要設備

離心機(冠森生物上海公司)、Thermo Hybaid px2 thermal cycler PCR儀(美國，Thermo Electron公司)、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000(美國，Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 引物設計和合成 通過基因序列分析軟件和引物設計分析軟件DNAman 6.0和Primer Premier 5.0，參考公開發(fā)表的豬源抗菌肽NK-lysin(Genbank: X85431.1)共保守區(qū)段設計引物AMP-234F和AMP-234R，可以擴增出234 bp的NK-lysin基因序列，由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 豬源抗菌肽NK-lysin的引物信息

1.4.2 目的片段擴增 取17～18周齡健康豬的新鮮小腸組織，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，-80 ℃保存或立即反轉錄成cDNA。在20 μL體系中進行反轉錄，42 ℃反轉錄15 min，70 ℃ 15 min，4 ℃保存；將得到的產(chǎn)物再用引物AMP-234F和AMP-234R進行PCR擴增，95 ℃預變性5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴增完成的PCR產(chǎn)物30 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段大小，與標準的DL2000 DNA Marker進行比較，觀察是否擴增出了234 bp的特異性片段。

1.4.3 PCR產(chǎn)物測序 將經(jīng)過PCR擴增鑒定與預計相一致的片段長度為234 bp的條帶切下，根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作步驟回收目的基因，送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.4.4 抗菌肽NK-lysin的生物信息學分析 根據(jù)測序結果，通過DNAman軟件對豬源抗菌肽NK-lysin序列與NCBI登錄的豬、家禽、魚類、綿羊和牛的NK-lysin序列進行基因序列同源性比較并繪制遺傳關系圖譜；通過ProParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對其基本性質進行分析；通過SOPMA tool(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)對其二級結構進行預測，并通過PHD數(shù)據(jù)庫查找其3D結構；通過 String tool(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=5RWaH208azBm&input_page_show_search=on)進行蛋白互作網(wǎng)絡分析[15]。

1.4.5 大腸桿菌的培養(yǎng)和純化 將保存于-80 ℃的大腸桿菌菌株室溫解凍，取少量接種于麥康凱液體培養(yǎng)基中，于搖床150 r/min、37 ℃培養(yǎng)18 h，用無菌接種環(huán)蘸取菌液，于麥康凱瓊脂平板表面劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌環(huán)挑取典型菌落，接種于10 mL液體麥康凱培養(yǎng)基中，于搖床150 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 藥物敏感性試驗 藥敏試驗按常規(guī)K-B法進行，挑取分離培養(yǎng)的單個大腸桿菌典型菌落增菌后均勻涂布在麥康凱平板上，用無菌鑷子將含有豬源抗菌肽成分的自制紙片(浸泡用藥液體積比為豬源抗菌肽∶水=1∶9)和利福平紙片緊貼于瓊脂表面，用無菌水制成的紙片做對照，每組3個重復，置37 ℃恒溫箱內18 h后，觀察結果。

1.4.7 大腸桿菌半數(shù)致死量(Median Lethal Dose，LD50)測定 大腸桿菌用液體麥康凱培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，冰箱保存?zhèn)溆?。隨機選取試驗小鼠90只，分為6組，6個攻毒組濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/mL，腹腔注射攻毒，0.2 mL/只。接種后觀察各組試驗小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況。觀察24 h，記錄死亡情況，計算大腸桿菌的LD50。

1.4.8 抗菌肽對小鼠感染大腸桿菌的預防作用 試驗動物在進行動物試驗前飼喂1周(飼料中不含任何抗生素)，使其適應試驗環(huán)境，確定健康后方可進行試驗。根據(jù)1.4.7測定結果確定菌液濃度，分組結果見表2。預防組每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽，細菌模型組注射等量生理鹽水；24 h后，預防組和細菌模型組每組以LD50腹腔注射大腸桿菌菌液0.2 mL/只，攻毒后，觀察各組試驗小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況。治療組以LD50腹腔注射大腸桿菌菌液0.2 mL/只，觀察各組試驗小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況，12 h后每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽。

表2 試驗分組及給藥

2 結果與分析

2.1 抗菌肽NK-lysin的RT-PCR擴增結果

將由豬小腸組織提取的RNA反轉錄后進行擴增，得到大小為234 bp的目的基因條帶(見圖1)，與預計期望得到的擴增目的基因條帶片段大小相一致。

2.2 抗菌肽NK-lysin的生物信息學分析結果

2.2.1 抗菌肽NK-lysin序列同源性分析 將經(jīng)過PCR擴增鑒定與預計相一致的條帶切下，回收目的基因，測序結果見圖2。

通過DNAman軟件對豬源抗菌肽NK-lysin序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，所測得的豬源抗菌肽NK-lysin序列與雞、白鯇、羅非魚、花鱸和野生日本鳴鶉等物種NK-lysin序列同源性均很低，存在較大的差異，與綿羊和牛的同源性均為69.66%；然而和NCBI登錄的豬源抗菌肽的同源性達97.78%(表3)。經(jīng)過對其他物種的NK-lysin進行進化樹的分析，從進化樹來看，該豬源抗菌肽與NCBI登錄的豬源抗菌肽保持高度同源；同時與家畜綿羊、牛分屬于同一分支，而與其他物種有很大變異(圖3)。

2.2.2 抗菌肽NK-lysin基本性質分析 通過ProParam tool分析可知，豬源抗菌肽NK-lysin預測的分子量是8834.68，包含78個氨基酸，其中賴氨酸含量最高，達到14.1%，其次是異亮氨酸，為12.8%。該蛋白的分子式為C380H664N112O109S9，理論等電點達到9.47，是一個穩(wěn)定的蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為36.01。豬源抗菌肽NK-lysin預計的半衰期在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞(體外)為30 h，在酵母(體內)中為20 h，在大腸桿菌中(體內)大于10 h。

2.2.3 抗菌肽NK-lysin二級結構預測 通過SOPMA tool預測可知，豬源抗菌肽NK-lysin二級結構為：α螺旋區(qū)域56個氨基酸，占71.79%；延伸鏈有7個氨基酸，占8.97%；β轉角區(qū)域有6個氨基酸，占7.69%；無規(guī)則卷曲區(qū)域有9個氨基酸，占11.54%。

通過PHD數(shù)據(jù)庫查找，得到其3D結構模型圖(圖4)。

M：DL2000 Marker；1：豬小腸組織；+：陽性對照；-：陰性對照

圖2 PCR產(chǎn)物測序結果

表3 豬源抗菌肽NK-lysin序列與NCBI登錄的NK-lysin序列的同源性

圖3 豬源抗菌肽NK-lysin的遺傳進化樹分析

2.2.4 抗菌肽NK-lysin互作網(wǎng)絡分析 通過String tool進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，表明豬源抗菌肽NK-lysin可以與4個蛋白發(fā)生相互作用，分別是IL-2、GZMB、ENSSSCG00000024337和SRRT(圖5)。而其中的ENSSSCG00000024337和SRRT為非特征性蛋白。

圖4 豬源抗菌肽NK-lysin的3D結構模型

圖5 豬源抗菌肽NK-lysin互作網(wǎng)絡分析結果

2.3 藥物敏感性試驗結果

豬源抗菌肽對大腸桿菌的體外抑制作用見表4。由表4可知，豬源抗菌肽和利福平對大腸桿菌都具有抑菌作用，但是豬源抗菌肽的抑菌圈直徑比利福平大，抑菌作用比利福平的抑菌作用強。

表4 藥物敏感性試驗結果

2.4 LD50的確定

小鼠人工感染大腸桿菌4 h后，各組試驗小鼠出現(xiàn)不同程度大腸桿菌感染癥狀，如精神沉郁、采食和飲水減少、腹瀉等臨床情況。各組小鼠死亡多發(fā)生在24～36 h。各組試驗小鼠的死亡情況見表5。通過公式，計算得到大腸桿菌的LD50=1.0×105.75cfu/mL，選用這個濃度為攻毒濃度，劑量為0.2 mL/只。

2.5 抗菌肽預防試驗結果

根據(jù)2.4測定結果確定菌液濃度，預防組每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽；24 h后，預防組和細菌組，每組以1.0×105.75cfu/mL腹腔注射大腸桿菌菌液，攻毒后，細菌模型組陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，如精神沉郁、采食和飲水減少、腹瀉等臨床情況，直至死亡；而預防組起初少部分出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，但后期出現(xiàn)恢復，最終的預防組存活率(80.00%)高于細菌模型組(46.67%)。而治療組在腹腔注射大腸桿菌菌液后陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，在其死亡前，即12 h，腹腔注射豬源抗菌肽，存活率達到了86.67%。各組試驗小鼠的存活情況見表6。

表5 各組試驗小鼠的死亡情況

表6 各組試驗小鼠的存活情況

3 討論

試驗通過提取豬小腸組織RNA、PCR擴增和測序得到豬源抗菌肽序列。通過分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽與NCBI登錄的豬源抗菌肽同源性很高，而與其他物種的同源性很低。雞源和牛蛙抗菌肽NK-lysin的生物學功能已經(jīng)明確，并有對其基本性質和二級結構進行分析[16-17]。王鵬等發(fā)現(xiàn)牛蛙抗菌肽粗提物具有穩(wěn)定的生物學活性，能夠減緩蛋雞產(chǎn)蛋性能的衰退，并能夠提高蛋雞的蛋品質與免疫力[18]。對豬源抗菌肽NK-lysin的生物信息學分析具有重要意義，也可為豬源抗菌肽NK-lysin的生物學功能研究提供參考。通過ProParam tool分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽在大腸桿菌中(體內)的半衰期大于10 h，遠長于其他來源抗菌肽的半衰期，這很可能與其具有抑菌作用有重要聯(lián)系，為進一步研究其作用機理提供了方向。

GZMB是外源性的絲氨酸蛋白酶，來自細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)和自然殺傷細胞(Natural Killer Cell，NK)釋放的細胞漿顆粒。有研究表明GZMB破壞了細菌的中間代謝和蛋白質合成，從而促成免疫細胞的死亡計劃[19]。而IL-2是一種白介素，是免疫系統(tǒng)中的一類細胞生長因子，能調控免疫系統(tǒng)中白血球的細胞活性，促進Th細胞(Helper T cell)和CTL的增殖，也參與抗體反應、造血和腫瘤監(jiān)視。有研究表明IL-2明顯延長結核桿菌H37RV株感染小鼠和豚鼠的半數(shù)死亡時間，降低死亡率，減少感染動物脾、肺組織內的結核桿菌數(shù)[20]。通過String tool進行蛋白互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽NK-lysin與IL-2和GZMb發(fā)生相互作用，因此很有可能是豬源抗菌肽NK-lysin激活了相關通路，使得IL-2和GZMb的表達量上調，提高機體免疫力，破壞細菌的生長和合成，從而起到抑菌的作用。

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對多種病原微生物均有抗菌活性。陳社生[21]應用利福平治療人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病，發(fā)現(xiàn)利福平可溶性粉劑對細菌性疾病有很好的療效，在生產(chǎn)上值得推廣應用。因此，本文選擇利福平作為參照，發(fā)現(xiàn)豬源抗菌肽的抑菌圈比利福平大，抑菌作用強。另外，細菌的耐藥性問題應引起注意，長期使用某一藥物很容易產(chǎn)生耐藥性，導致救治無效，造成重大經(jīng)濟損失。本研究結果對開發(fā)新一代的抗菌藥物抗菌肽意義重大。

豬源抗菌肽NK-lysin最初是從豬的脾臟、骨髓和大腸中分離到，該基因編碼的多肽與人顆粒溶素(Granulysin，GNLY)具有相似結構和抗菌特性，對細菌、真菌、原生動物、寄生蟲、腫瘤細胞等具有廣泛抑制殺滅活性[22-23]，其將成為抗生素的代替品，從而減少抗生素的使用。然而，對于豬源抗菌肽的研究僅僅停留在體外的抑菌試驗，其在動物體內的抑菌效果尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)：腹腔注射豬源抗菌肽的預防組小鼠，具有較強的大腸桿菌抵抗力，存活率達到80.00%；治療組在腹腔注射大腸桿菌菌液后陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，在其死亡前，即12 h，腹腔注射豬源抗菌肽，存活率達到了86.67%。說明豬源抗菌肽對大腸桿菌病具有預防和治療效果。