(陜西師范大學(xué)西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，陜西 西安 710119)

優(yōu)質(zhì)的種子是實現(xiàn)中藥材規(guī)范化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和首要條件，也是優(yōu)質(zhì)中藥材生產(chǎn)的源頭。但是，目前我國中藥種子缺乏全面系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。除了人參、三七、甘草等少數(shù)幾種中藥材種子建立了國家標(biāo)準(zhǔn)之外，很多中藥材種子還處于無標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)。近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，關(guān)于種子質(zhì)量差異及等級劃分標(biāo)準(zhǔn)的研究越來越多，如三七[1]、銀柴胡[2]、蒙古黃芪[3]、秦艽[4]、王不留行[5]、續(xù)斷[6]等。

中藥黃芩的基源植物為唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)，以根入藥，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[7]。其發(fā)揮藥效作用的化學(xué)成分主要是黃酮類成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等藥理作用[8]。黃芩種子質(zhì)量及其等級標(biāo)準(zhǔn)研究已有相關(guān)報道，孫志蓉等[9]通過測定黃芩質(zhì)量評價指標(biāo)和田間育苗試驗對黃芩種子質(zhì)量進(jìn)行了研究，并按種子大小進(jìn)行等級劃分；王峰偉等[10]研究不同來源黃芩種子質(zhì)量差異，并進(jìn)行了質(zhì)量評價指標(biāo)的相關(guān)性分析；李云靜等[11-12]以《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》為參照，建立了黃芩種子的質(zhì)量檢驗方法，并基于多元統(tǒng)計分析方法，進(jìn)行了黃芩種子質(zhì)量分級方法的研究。但是，這些報道都以市場銷售的黃芩種子為研究材料，對于在傳統(tǒng)小農(nóng)經(jīng)濟(jì)下的農(nóng)戶自采自種的種子質(zhì)量研究還未見報道；而且不同的種子質(zhì)量等級研究對于黃芩種子的質(zhì)量等級劃分存在不統(tǒng)一、不一致現(xiàn)象，難以對種子的質(zhì)量進(jìn)行有效的控制和評價。

本研究首次以農(nóng)戶家中實地收集到的10份不同產(chǎn)地的自種自采的黃芩種子為材料，通過測定黃芩種子的凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率、生活力、發(fā)芽勢等指標(biāo)來評價不同來源黃芩種子的質(zhì)量差異。并利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行了相關(guān)性分析、主成分分析、系統(tǒng)聚類分析、K-均值聚類分析后，通過綜合分析并結(jié)合實際生產(chǎn)情況，對所收集黃芩種子進(jìn)行了質(zhì)量等級劃分，以期為后續(xù)黃芩種子質(zhì)量評價及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 材料與儀器試劑

1.1 供試材料

供試材料為2018年7—10月調(diào)研全國主要產(chǎn)區(qū)黃芩生產(chǎn)種植情況時收集的10份黃芩種子。經(jīng)陜西師范大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalensis)的成熟種子。供試材料信息見表1。

表1 供試黃芩種子信息表

1.2 儀 器

人工氣候箱(中儀國科(北京)科技有限公司)，WG-71電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，實驗室PH計PE 20(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.3 試 劑

純凈水(自制)，無水乙醇(天津市天士力化學(xué)試劑有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京酷來搏科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 扦 樣

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣》(GB/T 3543.2)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[13]。凈度分析試驗樣品不少于2 500粒種子，送檢樣品量應(yīng)不少于凈度分析10倍量原則，確定凈度分析的最小樣品量不少于5 g。

2.2 凈度分析

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程凈度分析》(GB/T 3543.3)執(zhí)行[13]。采用四分法分取試驗樣品，將扦樣得到的種子，分別稱取20 g。放置于干凈白板，用鑷子將凈種子中的雜草種子、破碎干癟種子、殘留莖葉碎屑、細(xì)小石塊等雜質(zhì)選出。稱重，重復(fù)3次。計算種子凈度：

種子凈度(%)=(凈種子重量/樣品重量)×100%。

2.3 水分測定

依照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定》(GB/T 3543.6)執(zhí)行[13]。試驗采用高溫烘干法，在(135±1)℃高溫條件下烘干4 h測定每批種子的含水量。按下式計算種子含水量:

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

M1為樣品盒質(zhì)量，M2為樣品盒及樣品烘干前質(zhì)量，M3為樣品盒及樣品烘干后質(zhì)量。

2.4 重量測定[11]

將凈度分析后的凈種子均勻混合，采用“四分法”取樣。從中隨機(jī)抽取試驗所需要的種子數(shù)目，分別用百粒法、五百粒法和千粒法3種不同方法測定每份樣品的重量。其中百粒法和五百粒法重復(fù)3次，千粒法重復(fù)2次。分別計算平均值及變異系數(shù)。

2.5 種子生活力測定(TTC法)[14]

稱取2.5 g TTC放入燒杯中，先加少許95%的乙醇溶解后，加蒸餾水后稀釋定容至250 mL，再用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，配成1%TTC溶液，避光保存。對黃芩種子用水浸種24 h，挑選相對飽滿健全的種子(每處理3次重復(fù)，每選取50粒)，除去種皮，將種仁放入裝有1% TTC的染色器皿中，使染色液液面沒過種子表面，在25 ℃條件下染色8 h。倒出TTC溶液，用清水將種子沖洗1～2次，觀察種子染色情況。凡種胚全部或大部分被染成紅色的即為具有生活力的種子，種胚不被染色的為失去生活力的種子。

2.6 發(fā)芽率(勢)的測定

挑選飽滿成熟種子放置鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，在溫度25 ℃、光照/黑暗12 h/12 h條件下測定發(fā)芽率(勢)。每隔12 h記錄發(fā)芽數(shù)。每次實驗為100粒種子，每個產(chǎn)地重復(fù)3次。種子發(fā)芽以種子露出胚軸為準(zhǔn)。

發(fā)芽率(%)=(11 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(5 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 凈度及含水量檢驗

從表2可以看出，陜西府谷的黃芩種子凈度最高為95.60%，來自山西芮城的黃芩種子凈度最低為69.10%，凈度達(dá)到91.00%以上的黃芩種子有7份，占測試樣品的70.00%。不同來源黃芩種子含水量差異明顯，各批次種子含水量在5.63%～10.59%之間，平均含水量為7.90%。其中山西聞喜含水量最高，甘肅隴西含水量最低。說明農(nóng)戶對自種種子的凈度處理比較隨意，種子凈度普遍偏低，種子干燥程度不一致，影響著后續(xù)黃芩種植的播種量以及長期保存。

表2 黃芩種子的凈度及含水量分析(±s，n=3)

注：M1為樣品盒質(zhì)量，M2為樣品盒及樣品烘干前質(zhì)量，M3為樣品盒及樣品烘干后質(zhì)量；同列大寫字母表示p<0.01水平下的差異顯著性，同列小寫字母表示p<0.05水平下的差異顯著性。下同。

表3 黃芩種子千粒重的不同測定方法比較(±s，n=3)

表4 黃芩種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及生活力分析

3.2 千粒重檢驗

對不同來源的種子分別采用百粒法、五百粒法、千粒法測定黃芩的千粒重，分析結(jié)果見表3。通過方差分析，不同方法間無顯著性差異(p>0.05)，并且變異系數(shù)均小于3%，測定值均有效。因此，這3種方法均可用于黃芩種子的重量測定。這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的五百粒法和千粒法可用于黃芩種子的重量測定，百粒法不適宜千粒重測定的結(jié)果不盡相同，有待進(jìn)一步的研究[11]。不同來源黃芩種子間千粒重差異極顯著(p<0.01)，千粒重最小為1.451 0 g，最大為1.941 8 g。其中，范圍在1.50～1.80 g的種子占樣品總量的60%，說明黃芩種子的千粒質(zhì)量主要集中在此范圍內(nèi)。

3.3 發(fā)芽率、發(fā)芽勢及生活力檢驗

不同來源黃芩種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢都存在極顯著性差異(p<0.01)。由表4可知，山西陽城的發(fā)芽率最高，達(dá)到78.33%；山東莒縣的發(fā)芽率最低，只有41.33%。平均發(fā)芽率為63.53%，低于平均發(fā)芽率的有5份，占到總數(shù)的50%，可見采集到的黃芩種子發(fā)芽率普遍偏低。各批次材料發(fā)芽勢在39.67%～76.67%之間，不同試驗種子間差異明顯，平均發(fā)芽勢為59.53%。筆者在實地取樣過程中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地存在黃芩種子播種量差異大、出苗不齊的現(xiàn)象，猜測可能與農(nóng)戶自收種子的發(fā)芽率(勢)存在顯著差異有關(guān)。各批次試驗材料生活力在23.33%～94.66%之間，不同試驗種子存在極顯著差異(p<0.01)，其中，山東莒縣的種子生活力最低，為23.33%，甘肅漳縣次之，為54.00%。其余各批樣品生活力均在70%以上，除山東莒縣外，其余各批次平均生活力為79.92%。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)戶自種自采的黃芩種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及生活力都普遍偏低，而且不同產(chǎn)地之間差異極顯著。

表5 黃芩種子各指標(biāo)測定結(jié)果均值(n=3)

3.4 測定指標(biāo)匯總

黃芩種子測定指標(biāo)數(shù)據(jù)平均值匯總，見表5。

4 黃芩種子質(zhì)量分析與分級

4.1 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果見表6，黃芩種子的凈度和水分、千粒重、發(fā)芽率發(fā)芽勢呈正相關(guān)關(guān)系，與生活力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，均沒有達(dá)到顯著水平；種子含水量與千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與生活力呈正相關(guān)關(guān)系，未達(dá)到顯著水平；黃芩種子的千粒重與發(fā)芽率、生活力、發(fā)芽勢呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，未達(dá)到顯著水平；黃芩種子發(fā)芽率與生活力呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.764，與發(fā)芽勢達(dá)到極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.972；生活力與發(fā)芽勢呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.652。

表6 黃芩種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)相關(guān)性分析

注：*表示在0.05水平相關(guān)性顯著，**表示在0.01水平相關(guān)性顯著。

4.2 主成分分析及結(jié)果

主成分分析結(jié)果見表7，前3個特征值累積貢獻(xiàn)率已達(dá)到90.587，說明前3個主成分基本包含了全部的指標(biāo)信息。取前3個特征值，并計算出相應(yīng)的特征向量。前3個主成分為：

F1=-0.152X1-0.158X2-0.265X3+0.331X4+0.319X5+0.325X6；

F2=0.498X1-0.548X2+0.522X3+0.348X4-0.325X5+0.376X6；

F3=0.879X1+0.796X2+0.144 5X3+0.991X4+0.431X5+0.621X6。

式中：X1為凈度；X2為水分；X3為千粒重；X4為發(fā)芽率；X5為生活力；X6為發(fā)芽勢。

綜合來看，在第1主成分表達(dá)式中，發(fā)芽率X4、生活力X5、發(fā)芽勢X6指標(biāo)的系數(shù)較大，由4.1相關(guān)性分析得知，發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈極顯著相關(guān)，可以將二者合并為一項即發(fā)芽率作為種子等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，又因第1主成分的方差貢獻(xiàn)率最高，因此，本研究將發(fā)芽率和生活力作為黃芩種子分級的主要指標(biāo)，千粒重和凈度為參考指標(biāo)。

表7 主成分方差貢獻(xiàn)

4.3 系統(tǒng)聚類分析及結(jié)果

聚類分析結(jié)果見圖1，10批種子在閾值為5處聚為3類。第一類群包括2(山西芮城)、3(山西夏縣)、4(山西襄汾)、5(山西陽城)、7(陜西府谷)、8(甘肅隴西)6份材料，該類群具有發(fā)芽率高、生活力強(qiáng)的顯著優(yōu)勢；第二類群包括6(山西聞喜)、9(甘肅漳縣)、10(甘肅宕昌)3份材料，為中間類群；第三類群包括1(山東莒縣)1份材料，該類群具有發(fā)芽率、生活力都最低。所以可以將黃芩種子分為即優(yōu)、良和不合格3級。黃芩種子顏色有黑色和灰黑色的區(qū)別，但聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子顏色與這4項評價黃芩質(zhì)量的指標(biāo)沒有必然聯(lián)系，可以認(rèn)為黃芩種子質(zhì)量與其顏色黑、灰黑無關(guān)。

圖1 黃芩種子4項指標(biāo)系統(tǒng)聚類分析

4.4 單項指標(biāo)K-均值聚類分析

通過K-均值聚類分析，界定黃芩種子分級指標(biāo)的范圍，結(jié)果見表8。

表8 黃芩種子單項指標(biāo)K-均值聚類分析結(jié)果

4.5 綜合分析結(jié)果

通過黃芩種子測定指標(biāo)的相關(guān)性分析和主成分分析，確定黃芩種子質(zhì)量等級劃分以發(fā)芽率和生活力為主要指標(biāo)，千粒重和凈度為參考指標(biāo)。同時采用系統(tǒng)聚類分析對黃芩種子進(jìn)行等級數(shù)的界定，K-均值聚類分析對黃芩種子分級指標(biāo)界定。通過綜合分析并結(jié)合實際生產(chǎn)情況，適當(dāng)調(diào)整分級指標(biāo)，初步制定黃芩種子質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表9。分級方法采用最低定級原則，即任何一項不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能定為相應(yīng)等級的合格種子。

表9 黃芩種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)

5 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地農(nóng)戶自種自采的黃芩種子質(zhì)量普遍低下，且不同產(chǎn)地之間質(zhì)量差異明顯。不同來源的種子凈度和含水量存在顯著差異，反應(yīng)了農(nóng)戶對自種種子含水量控制和凈度處理比較隨意，導(dǎo)致種子凈度普遍偏低，種子干燥程度不一致，影響了種子壽命和播種量。筆者在實地取樣過程中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地存在黃芩種子播種量不一致、出苗不齊的現(xiàn)象，推測不同產(chǎn)地間黃芩種子凈度、發(fā)芽率、發(fā)芽勢及生活力存在極顯著差異可能是導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因。研究發(fā)現(xiàn)，百粒法、五百粒法、千粒法3種方法均可用于黃芩種子千粒重的測定。不同來源黃芩種子千粒重存在極顯著性差異，主要集中在1.50～1.80 g之間，千粒重的差異可能是黃芩不同種質(zhì)所決定的。黃芩種子顏色有黑色和灰黑色之別，分析發(fā)現(xiàn)，種子顏色的不同與反應(yīng)黃芩種子質(zhì)量的相關(guān)指標(biāo)之間并無質(zhì)量優(yōu)劣的聯(lián)系，這與李小玲等[14]報道的黑色種子的質(zhì)量顯著高于灰黑的種子，而黑色并帶有光澤的種子質(zhì)量最好的觀點(diǎn)并不一致。筆者認(rèn)為，黃芩種子顏色的差異不一定是其成熟度不同造成的，也可能是黃芩不同種質(zhì)之間存在的差別。

在黃芩種子等級劃分過程中，利用統(tǒng)計軟件對測定指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析和主成分分析，確定以發(fā)芽率、生活力、千粒重和凈度為分級指標(biāo)。這與王峰偉等[10]、李云靜等[12]、李小玲等[14]報道的質(zhì)量劃分標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量評價指標(biāo)選擇有契合之處，反映了選定這4個指標(biāo)作為種子等級劃分的合理性和普適性。本研究采用系統(tǒng)聚類分析進(jìn)行等級數(shù)的界定，K-均值聚類分析進(jìn)行分級指標(biāo)范圍的界定。結(jié)合實際生產(chǎn)情況，初步制定黃芩種子質(zhì)量等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，該劃分方法科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、合理，可以作為黃芩種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)劃分參考。在該標(biāo)準(zhǔn)下，10批樣品種子質(zhì)量為優(yōu)的種子有3份，分別為山西襄汾、山西陽城、陜西府谷；質(zhì)量為良的有4份，分別為山西芮城、山西聞喜、甘肅隴西、甘肅宕昌；不合格種子有3份，分別為山東莒縣、山西夏縣和甘肅漳縣。按照李云靜等[12]制定的黃芩種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該10批樣品中能達(dá)到一級的種子有4份，分別為山西襄汾、山西陽城、陜西府谷、甘肅隴西，其余均為二級種子。根據(jù)王峰偉等[10]制定的標(biāo)準(zhǔn)，沒有任何樣品種子能達(dá)到一級；二級種子有2份，分別為山西襄汾和陜西府谷；其余均為三級種子。李小玲等[14]以陜西商洛黃芩種子為材料建立了種子標(biāo)準(zhǔn)，在該標(biāo)準(zhǔn)下，收集到的10批樣品種子均未達(dá)到一級；二級種子有2份，分別為山西襄汾和陜西府谷；其余均為三級種子。從上述對比來看，在不同的分級標(biāo)準(zhǔn)之下，收集到的黃芩種子劃分的等級不一致，能夠達(dá)到優(yōu)質(zhì)種子標(biāo)準(zhǔn)的很少。這既反映所收集到的農(nóng)戶自種自采種子質(zhì)量低下的現(xiàn)狀，也反映了目前黃芩種子質(zhì)量缺乏統(tǒng)一性好、普適范圍廣、科學(xué)合理的等級劃分標(biāo)準(zhǔn)。

優(yōu)良的種子是提高藥材產(chǎn)量、質(zhì)量和高品質(zhì)優(yōu)質(zhì)藥材生產(chǎn)的前提。中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定需要種子生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化，包括良種選育、生產(chǎn)儲運(yùn)、質(zhì)量分級、檢驗規(guī)程等系列工程，其中首要任務(wù)就是種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。本研究通過實地收集全國不同產(chǎn)地的黃芩種子，首次研究了不同產(chǎn)地農(nóng)戶自種自采的黃芩種子質(zhì)量差異；利用統(tǒng)計分析方法結(jié)合實際農(nóng)戶生產(chǎn)情況，嘗試制定了種子質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)黃芩種子質(zhì)量評價及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了一定的參考依據(jù)；同時，對比已有的黃芩種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，發(fā)現(xiàn)黃芩種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究還需進(jìn)一步完善，相關(guān)工作有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究。