焦 瑋,魏 凌，胡明明，李建國

放射治療(放療)是乳腺癌治療的重要手段之一，而腫瘤細胞對放射的不敏感性是影響放射治療的重要因素。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明,乳腺癌細胞中特異或差異性表達的一些微小RNA(microRNAs，miRNAs)在放療抵抗過程中發(fā)揮著重要作用，而干擾或過表達這些miRNAs可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對放療的抵抗，增加放療的敏感性[1-3]。miRNA(miR)-125b與腫瘤進展密切相關(guān)miRNA，在細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用[4]。miR-125b在乳腺癌等中異常低表達，被證實在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和放療過程過程中發(fā)揮著積極作用[5-6]，但其在腫瘤細胞放射增敏過程中的機制卻知之甚少。己糖激酶-2(HK2)是糖酵解過程中的一種關(guān)鍵限速酶，被證實沉默其表達可增強乳腺癌細胞的放療敏感性[7]。本研究通過生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，HK2可能是miR-125b的潛在靶基因。因此，猜測miR-125b可能通過靶向抑制HK2表達在乳腺癌細胞中發(fā)揮放射增敏作用，故設(shè)計實驗加以驗證。本研究以乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，通過觀察miR-125b和HK2的靶向關(guān)系，探討miR-125b增強乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，二甲基亞砜、MTT試劑和胰蛋白酶購于美國Sigma公司，LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司，PVDF膜購于德國Roche公司，兔抗人β-action多克隆抗體購于美國Santa Cuze公司，鼠抗人HK2單克隆抗體購于美國 Abcam公司，辣根標記羊抗兔/鼠IgG二抗購于北京博奧森公司?？俁NA提取試劑盒購于北京天根生化公司，Bradford 蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒購于上海Beyotime公司，AnnexinV-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購于南京凱基公司，HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒購和蛋白抽提試劑盒于北京康為世紀生物公司，Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海力敏實業(yè)公司。miR-125b模擬物及其陰性對照以及HK2真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-HK2由廣州銳博生物公司設(shè)計合成。凝膠成像系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購于蘇州凈化設(shè)備制造廠，流式細胞儀購于美國Becton Dickinson公司，醫(yī)用直線加速器購于美國 Varian公司，PCR儀購于德國SensoQuest Lab Cycler公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清) 于5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞(來自于中科院上海細胞庫)。當細胞融合度超過85%時，采用0.25%胰蛋白酶消化傳代。實驗所有細胞均處于對數(shù)生長期。將對數(shù)生長期細胞接種至6孔細胞板上，培養(yǎng)至70%～80%匯合度時，參照LipofectamineTM2000說明書將miR-125b模擬物及其陰性對照轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中，并標記為miR-125b組和miR-NC組。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細胞采用RT-PCR檢測細胞中miR-125b的表達以評價轉(zhuǎn)染效果。

1.3 RT-PCR檢測miR-125b和HK2mRNA的表達 根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書步驟提取MCF-7細胞的總RNA，并采用核酸濃度檢測儀檢測RNA的濃度。按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。由上海生工合成的PCR引物分別為miR-125b正向引物：5′-CGT CCC TGA GAC CCT AAC TTG T-3′，反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCG CGT CGT GAA GCG TTC-3′，反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；HK2正向引物：5′-AAG GCT TCA AGG CAT CTG-3′，反向引物：5′-CCA CAG GTC ATC ATA GTT CC-3′；內(nèi)參β-actin正向引物：5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′，反向引物：5′-CGT GAG AAG GTC GGA AGG AA-3′。取PCR正反向引物(濃度為10 μmol/L)各2 μL、模板cDNA 2 μL、2×Taq Master Mix 25 μL和RNase-Free Water 18 μL配制成總體積為50 μL的PCR反應體系，上PCR儀按照94 ℃ 2 min(預變性)，94 ℃ 30 s(變性)、58 ℃ 30 s(退火)、72 ℃ 30 s(延伸)，共38個循環(huán)進行PCR擴增。采用2-△△CT法檢測miR-125b和HK2 mRNA的表達水平。

1.4 Western blotting檢測HK2蛋白的表達 參照蛋白抽提試劑盒說明書步驟提取MCF-7細胞的總蛋白后，采用Bradford法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與1/4體積的5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混勻后置于沸水中煮沸5 min。取變性蛋白，以每孔60 μg上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳。待蛋白充分分離后，結(jié)束電泳。采用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。取出PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉TBST 封閉液中封閉1 h。封閉液洗膜后，加入封閉液稀釋的HK2抗體(工作濃度1∶500)，4 ℃孵育24 h。洗膜后，加入辣根標記羊抗兔/鼠IgG二抗(工作濃度1∶1 000)室溫下孵育2 h。再次洗膜后，采用化學發(fā)光法顯影及定影，BIO-RAD成像儀分析。以目的蛋白HK2與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比較表示HK2蛋白的相對表達水平。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-125b和HK2的靶向關(guān)系 采用TargetScan預測軟件預測HK2 3′UTR 與miR-125b存在互補的核苷酸序列。為了驗證miR-125b和HK2之間是否存在靶向關(guān)系，分別設(shè)計合成野生型(HK2-WT)和突變型(HK2-MUT)的HK2 3′UTR熒光素酶報告載體，將其分別與miR-125b 模擬物及其陰性對照共轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞中，并分別標記為miR-125b+HK2-WT組、miR-125b+HK2-MUT組、miR-NC+HK2-WT組和miR-NC+HK2-MUT組。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.6 實驗分組與細胞照射 將對數(shù)生長期MCF-7細胞分為3組：miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物陰性對照)、miR-125b組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物)和miR-125b+HK2組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和pcDNA3.1-HK2質(zhì)粒)。根據(jù)上述分組采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染48 h后，采用6MV-X射線對各組細胞按照200 cGy/min照射劑量率、20 cm×20 cm照射野面積和100 cm固定源皮距進行照射。

1.7 克隆形成實驗檢測各組細胞的放射生物學參數(shù) 胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，調(diào)整細胞濃度為2×103個/毫升，按照每孔2 mL接種至6孔細胞板上，培養(yǎng)過夜。以0、2、4、6和8 Gy劑量的X射線垂直照射各組細胞，照射結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)12 d后終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液后，以甲醇固定細胞10 min，姬姆薩染液染色20 min。顯微鏡下觀察，以超過50個細胞集落作為有效克隆，以(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%表示克隆形成率(PE)，并根據(jù)公式：存活分數(shù)(SF)=克隆數(shù)/(PE×接種細胞數(shù))計算各組細胞的存活分數(shù)。根據(jù)多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，記錄平均致死量(D0)、準閾劑量(Dq)、2Gy劑量下對應的SF值(SF2)和增敏比(SER)放射生物學參數(shù)。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 給予4 Gy劑量X射線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化收集各組細胞，調(diào)整細胞濃度，使每毫升細胞懸液中含有105個細胞。參照細胞凋亡試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用單因素方差分析、q檢驗和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物上調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中miR-125b的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物后MCF-7細胞中miR-125b的表達水平(4.25±0.16)較miR-NC組(0.96±0.07)顯著升高(t=32.63，P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物下調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中HK2 mRNA和蛋白的表達 RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物后MCF-7細胞中HK2 mRNA和蛋白的表達水平分別為0.35±0.03和0.27±0.03，較miR-NC組中HK2 mRNA和蛋白的表達水平(1.02±0.09和0.88±0.07)均顯著降低(tmRNA=12.23，P<0.01；t蛋白=13.87，P<0.01)(見圖1)。

2.3 HK2是miR-125b的靶基因 TargetScan生物信息學軟件預測結(jié)果顯示，HK2的3′UTR中存在與miR-125b互補的結(jié)合位點，詳見表1。同時，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和HK2-WT質(zhì)粒的MCF-7細胞的熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染miR-NC和HK2-WT質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)；但與共轉(zhuǎn)染miR-NC和HK2-MUT質(zhì)粒相比，共轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物和HK2-MUT質(zhì)粒的MCF-7細胞的熒光素酶活性無顯著改變(P>0.05)(見表2)。

表1 miR-125b與HK2 3′ UTR的結(jié)合位點

表2 各MCF-7細胞的熒光素酶活性的比較

q檢驗：與miR-NC + HK2-WT組比較* *P<0.01

2.4 miR-125b過表達靶向調(diào)控HK2增強乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性 RT-PCR檢測得到miR-NC組、miR-125b組和miR-125b+HK2組細胞中HK2 mRNA的相對表達量分別為1.00±0.06、0.34±0.02和0.65±0.03，Western blotting檢測得出HK2蛋白的相對表達量分別為1.02±0.08、0.27±0.02和0.45±0.03(見圖2)；各組細胞間HK2 mRNA和蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(FmRNA=200.27，P<0.01，MS組內(nèi)=0.002；F蛋白=179.18，P<0.01，MS組內(nèi)=0.003)；與miR-NC組相比，HK2 mRNA和蛋白的表達水平在miR-125b組細胞中顯著降低(P<0.01)，而miR-125b+HK2組與miR-125b組相比顯著升高(P<0.01)。根據(jù)打擊多靶模型擬合MCF-7細胞的生存曲線見圖3，各組細胞的放射相關(guān)參數(shù)見表2。與miR-NC組相比，miR-125b組細胞的存活分數(shù)明顯降低(P<0.01)，放射增敏比SER為1.44；與miR-125b組相比，miR-125b+HK2組細胞的存活分數(shù)明顯升高(P<0.01)，細胞增敏比為0.69。給予4 Gy劑量X射線照射后，流式細胞儀檢測miR-NC組、miR-125b組和miR-125b+HK2組的細胞凋亡率分別為(7.58±0.12)%、(20.64±0.23)%和(13.26±0.13)% ；與miR-NC組相比，miR-125b組細胞凋亡率明顯升高(t=86.31，P<0.01)；而miR-125b+HK2組細胞的凋亡率較miR-125b組顯著降低(t=47.91，P<0.01)(見圖4)。

表3 各組細胞的放射生物學參數(shù)比較

分組D0/GyDq/GySF2SERmiR-NC2.473.480.91miR-125b1.261.350.491.44miR-125b+HK21.821.580.620.69

3 討論

miRNAs是一類可通過與靶基因3′UTR區(qū)域特異性結(jié)合調(diào)控靶基因表達的短鏈非編碼 RNA，腫瘤細胞中異常表達的miRNAs不僅與細胞的DNA修復、增殖和凋亡等有關(guān)，還與細胞的放射敏感性關(guān)系密切[8-9]。本研究關(guān)注的miR-125b就是一個很好的例子?？谇击[癌中下調(diào)的miR-125b表達與細胞增殖和抗輻射機制有關(guān)，上調(diào)其表達可增強放射的敏感性[10]。miR-125b在乳腺癌細胞中低表達，而上調(diào)其表達可通過靶向KIAA1522抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移[5]；同時，強制表達miR-125b可通過降低克隆生存率、增強凋亡活性和增強紅外線后的衰老等提高放射敏感性[6]。然而，miR-125b在乳腺癌細胞放射致敏中的分子機制并不完全清楚。miRNA可與靶基因形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)控細胞的生長，本研究認為miR-125b可能通過調(diào)控其靶基因發(fā)揮放射增敏作用。

有研究[11-12]證實，miR-125b在骨肉瘤和喉鱗狀細胞癌中表達下調(diào)，可通過直接靶向調(diào)控HK2表達抑制癌細胞的有氧糖酵解過程，進而抑制腫瘤的惡性進展。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物上調(diào)乳腺癌MCF-7細胞中的miR-125b表達后，檢測到HK2從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均明顯受到抑制；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步檢測證實miR-125b可與HK2 3′UTR區(qū)域結(jié)合。這表明HK2是miR-125b的潛在靶基因。

電離輻射使細胞DNA雙鏈斷裂進而引起癌細胞死亡的過程是放射治療的內(nèi)在機制，而機體細胞自身的DNA修復系統(tǒng)是導致放射不敏感的重要機制；HK2是糖酵解起始過程中的關(guān)鍵限速酶，而糖酵解過程產(chǎn)生的ATP是DNA合成獲得能量的重要方式，可見HK2與DNA修復斷裂關(guān)系密切[13-14]。同時，HK2還是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的致癌基因，在腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡中發(fā)揮著重要作用，并介導腫瘤的治療耐受。HK2在胰腺導管腺癌中表達上調(diào)，敲低其表達通過降低乳酸的產(chǎn)生抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，上調(diào)其表達則促進細胞的生長和轉(zhuǎn)移[15]；在膠質(zhì)母細胞瘤中，靶向抑制HK2表達可增強腫瘤細胞的放射化療反應[16]；在HPV16 E7誘導的宮頸癌中，靶向抑制HK2表達可增強腫瘤細胞的放射敏感性，抑制細胞增殖并促進細胞凋亡[17]。已有研究[7,18]證實，靶向抑制HK2表達可增強乳腺癌細胞的放射敏感性。本研究在上調(diào)miR-125b表達后進一步檢測發(fā)現(xiàn)，X射線照射的MCF-7細胞的存活分數(shù)降低，凋亡率升高，這表明miR-125b過表達可增強MCF-7細胞的放射敏感性；而轉(zhuǎn)染HK2真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-HK2成功上調(diào)HK2表達后，miR-125b過表達對MCF-7細胞的放射增敏作用明顯受到抑制，提示miR-125b可通過靶向抑制HK2增強MCF-7細胞的放射敏感性。

綜上所述，miR-125b在乳腺癌MCF-7細胞中發(fā)揮著放射增敏作用，而靶向抑制HK2表達可能是其重要的分子機制，為miR-125b成為乳腺癌放射增敏的分子靶點提供了新的實驗依據(jù)。