李晶晶，祖 磊，薛鵬程

血脂代謝異常在動(dòng)脈粥樣硬化中的重要作用已被證實(shí)。研究[1]表明，血脂水平異常升高促進(jìn)脂質(zhì)沉積，并在動(dòng)脈粥樣硬化的形成及粥樣斑塊發(fā)展進(jìn)程具有重要作用。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷小鼠是目前通過基因敲除手段研究血脂代謝紊亂形成動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型，最新研究[2]發(fā)現(xiàn)糖尿病可進(jìn)一步誘發(fā)ApoE-/-小鼠血脂代謝紊亂，加重動(dòng)脈硬化發(fā)生。TR3受體作為孤核受體超家族的成員，介導(dǎo)了許多種激素、維生素和藥物細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)[3]。有研究[4]顯示TR3受體激活后增加糖尿病病人對(duì)胰島素敏感性，加速血糖代謝，降低血糖水平，減輕糖尿病糖代謝性疾??；也有研究發(fā)現(xiàn)TR3受體可降低細(xì)胞增殖核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)/ 細(xì)胞周期蛋白D1(cylinD1)蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖；在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)斑塊組織NF-κB/cylinD1蛋白表達(dá)水平增高，同時(shí)動(dòng)脈硬化斑塊周圍平滑肌層細(xì)胞增生明顯，降低NF-κB p65/CylinD1表達(dá)，斑塊周圍增生細(xì)胞明顯減少，減緩動(dòng)脈粥樣斑塊的形成[5]。因此我們認(rèn)為TR3受體對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠血脂代謝、細(xì)胞增殖調(diào)控NF-κB/CylinD1通路與動(dòng)脈硬化斑塊形成與發(fā)展有密切相關(guān)，本研究將觀察TR3受體激動(dòng)劑(6-mercaptopurine，6-MP)對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠糖脂代謝及NF-κB p65/CylinD1通路的影響，探討TR3受體激動(dòng)劑改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 ApoE-/-小鼠(SPF級(jí))購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、6-MP(Sigma公司)，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、NF-κB p65/CylinD1一抗(CST公司)，HRP標(biāo)記二抗(北京中杉公司)，丙烯酰胺、Tris-base(Ameresco)，PVDF膜(millipore公司)，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz公司)。

1.2 動(dòng)物分組 8周齡SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量(23±2)g，飼養(yǎng)條件，室溫(22±2)℃，濕度(55±5)%，人工光照明暗各12 h/d，24 h自由取食飲水，飼料由上海斯萊克公司提供。隨機(jī)選取10只ApoE-/-小鼠為對(duì)照組(ApoE-/-組)，糖尿病小鼠30只，隨機(jī)抽樣法分為3組(每組10只)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為4組：ApoE-/-組(n=10)，STZ+ApoE-/-組(n=10)，STZ+ApoE-/-+6-MP 2.5 mg·kg-1·d-1組(n=10)，STZ+ApoE-/-+6-MP 5 mg·kg-1·d-1(n=10)。將6-MP溶于0.9%氯化鈉溶液中，腹腔注射法給藥，1次/天，連續(xù)8周，其余各組動(dòng)物均用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/天。

1.3 ApoE-/-小鼠腹腔注射STZ建立糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型 STZ配制：檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 4.4)10 mL加100 mg STZ充分溶解(STZ濃度：10 mg/mL)，所有動(dòng)物禁食12 h，于腹腔注射STZ：檸檬酸溶液0.01 mL/g，給藥后立即給予飼料自由取食，3 d后測(cè)定小鼠空腹血糖，動(dòng)物血糖水平于12～25 mmol/L用于本試驗(yàn)。

1.4 HE染色 取小鼠胸主動(dòng)脈弓下0.5 cm，PBS漂洗2～3次，10%甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，中性樹脂封片，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積采用自動(dòng)成像分析軟件系統(tǒng)(Olympus,Japan)分析，求斑塊面積平均值。

1.5 Western-blotting測(cè)小鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65/CylinD1蛋白表達(dá) 小鼠胸主動(dòng)脈總蛋白提?。喝⌒∈笮刂鲃?dòng)脈弓約1 cm，去除血管外膜結(jié)締組織，0.9%氯化鈉溶液漂洗1～2次，加0.5 mL RIPA裂解緩沖液[含0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris.Cl pH7.6，0.001 mol/L EDTA，100 mmol/L DTT，1 μg/mL抑肽酶(1∶100)，100 μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)]勻漿，加入0.5 mL 2×SDS上樣緩沖液，劇烈震蕩15 s,-80 ℃冰箱凍融2次，100 ℃水浴10 min，12 000 g，4 ℃離心，取上清，凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影等步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠血糖的影響 與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)；TR3受體激動(dòng)劑6-MP可呈劑量依賴性降低糖尿病ApoE-/-小鼠空腹血糖水平(P<0.01)，與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+6-MP5組小鼠空腹血糖水平顯著降低(P<0.01)，STZ-ApoE-/-+6-MP 10組空腹血糖水平進(jìn)一步降低(P<0.01)(見表1)。

分組n血糖/(mmol/L)ApoE-/-組106.91±0.69STZ-ApoE-/-組1018.68±2.30??STZ-ApoE-/-+6-MP5組1015.42±2.68??#STZ-ApoE-/-+6-MP10組1013.64±1.95??##F—40.07P—<0.01MS組內(nèi)—3.090

q檢驗(yàn)：與ApoE-/-組比較**P<0.01;與STZ-ApoE組比較#P<0.05,##P<0.01

2.2 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠血脂代謝的影響 與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠空腹總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)顯著升高(P<0.01)，2組間高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和三酰甘油(TG)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TR3受體激動(dòng)劑 6-MP呈劑量依賴性降低糖尿病ApoE-/-組小鼠空腹TC、LDL-C、TG水平；與STZ-ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-+6-MP 5組小鼠空腹血脂TC、LDL-C、TG水平均顯著降低(P<0.01)，STZ-ApoE-/-+6-MP10組空腹血脂TC、LDL-C、TG進(jìn)一步降低(P<0.01)；STZ-ApoE-/-組、STZ-ApoE-/-+6-MP5及STZ-ApoE-/-+6-MP10三組HDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.3 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65、CylinD1蛋白表達(dá)的影響 與C57組相比，ApoE-/-組小鼠肝臟FGF21 mRNA及蛋白表達(dá)水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組小鼠肝臟FGF21 mRNA、蛋白及血清FGF21水平均明顯增高(P<0.01)；FGF21 miRNA可顯著降低糖尿病ApoE-/-小鼠肝臟FGF21 mRNA、蛋白及血清FGF21水平(P<0.05)(見圖1、表3)。

2.4 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積的影響 ApoE-/-組胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜有少量小團(tuán)塊狀紅染脂質(zhì)，STZ-ApoE-/-組胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜有片狀團(tuán)塊狀紅染脂質(zhì)；STZ-ApoE-/-+6-MP5組或STZ-ApoE-/-+6-MP10組胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜少量小片狀紅染脂質(zhì)(見圖2)。

2.5 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣斑塊形成的影響 ApoE-/-組主動(dòng)脈血管內(nèi)膜可見小硬化斑塊，斑塊底部血管增厚；STZ-ApoE-/-組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜可見巨大斑塊突起，斑塊中央有空洞形成，斑塊底部血管增厚且不規(guī)則，斑塊空腔周圍可見大量細(xì)胞增生；STZ-ApoE-/-+6-MP5組主動(dòng)脈血管內(nèi)膜硬化斑塊斑塊較小，斑塊中央空洞較小，斑塊底部及周圍有少量增生組織；STZ-ApoE-/-+6-MP5組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜只見小硬化斑塊隆起，斑塊底部及周圍有少量增生組織(見圖3)。

表2 TR3受體激動(dòng)劑 6-MP對(duì)糖尿病ApoE-/-小鼠血糖和血脂的影響

q檢驗(yàn)：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01 ；與STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

分組nNF-κB p65Cylin D1 ApoE-/-組100.053±0.0080.234±0.026STZ-ApoE-/-組100.358±0.046??0.617±0.107??STZ-ApoE-/-+6-MP5組100.213±0.025??##0.226±0.031##STZ-ApoE-/-+6-MP10 組100.022±0.003??##0.109±0.013??##F—343.51147.62P—<0.01<0.01MS組內(nèi)—0.0010.003

注：蛋白印跡電泳膠片條帶光密度(OD值)分析，NF-κB p65或CylinD1/β-actin光密度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。q檢驗(yàn)：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01；與STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

斑塊面積分析：與ApoE-/-組相比，STZ-ApoE-/-組胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜斑塊面積明顯增加(P<0.05)；TR3受體激動(dòng)劑 6-MP可呈劑量依賴的方式抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈硬化斑塊增加，與STZ-ApoE-/-組相比STZ-ApoE-/-+6-MP 5組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積明顯降低(P<0.05)；STZ-ApoE-/-+6-MP10組與STZ-ApoE-/-+6-MP 5組之間斑塊面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4)。

分組n斑塊面積/μm2ApoE-/-組10123.56±15.38STZ-ApoE-/-組10245.16±30.29??STZ-ApoE-/-+6-MP5組10172.43±20.55??##STZ-ApoE-/-+6-MP10 組10154.09±18.73??##F—55.40P—<0.01MS組內(nèi)—481.786

q檢驗(yàn)：與ApoE-/-組比較*P<0.05，**P<0.01 ；STZ-ApoE-/-組比較#P<0.05，##P<0.01

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，鏈尿左菌素誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠血糖水平升高，血脂代謝進(jìn)一步異常，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積與斑塊面積也顯著增加，說明糖尿病可導(dǎo)致血脂紊亂，加速ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。即往研究已證實(shí)糖尿病是冠心病重要危險(xiǎn)因素，其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均起著至關(guān)重要的作用[6-7]；本研究又觀察到用TR3受體激動(dòng)劑6-MP治療的STZ誘導(dǎo)糖尿病ApoE-/-小鼠可降低血糖水平，改善血脂代謝，減少胸主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積及斑塊面積，說明TR3受體激動(dòng)劑6-MP可改善糖尿病ApoE-/-小鼠糖脂代謝，減緩糖尿病誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展。在TR3受體激動(dòng)劑6-MP抑制平滑肌細(xì)胞增殖的研究中已證實(shí)6-MP可以激活TR3進(jìn)而抑制靜脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖[8]。最近有相關(guān)研究又發(fā)現(xiàn)TR3核受體可與肝核受體LXR結(jié)合，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)糖的攝取，降低血糖水平[9-10]。也有研究[11]認(rèn)為TR3核受體激活血脂的改善是由于血糖水平降低引起的，更有研究[12]認(rèn)為TR3核受體可直接促進(jìn)肝及脂肪組織脂質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少糖尿病引起脂肪代謝紊亂。因此TR3核受體激激動(dòng)劑被認(rèn)為治療高血糖性代謝疾病藥物。我們研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞周期調(diào)控蛋白NF-κBp65及Cylin D1表達(dá)水平顯著增加，胸主動(dòng)脈斑塊周圍大量增生組織，說明糖尿病不但可誘發(fā)脂質(zhì)斑塊形成，同時(shí)可促進(jìn)斑塊周圍組織細(xì)胞增生，并與糖尿病ApoE-/-小鼠NF-κB p65，Cylin D1高表達(dá)有關(guān)。相關(guān)動(dòng)脈硬化的研究也證實(shí)動(dòng)脈斑塊周圍組織增生與NF-κB p65，Cylin D1水平密切相關(guān)，認(rèn)為巨噬細(xì)胞侵入動(dòng)脈中膜形成泡沫細(xì)胞過程增加平滑肌層細(xì)胞NF-κB p65，Cylin D1表達(dá)水平，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，加速斑塊形成[13]。有研究認(rèn)為NF-κB p65，Cylin D1增加導(dǎo)致平滑細(xì)胞增生具有穩(wěn)定斑塊作用[14]；也有研究認(rèn)為NF-κB p65，Cylin D1也可促進(jìn)斑塊底部平滑肌層增生可增斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究用TR3受體激動(dòng)劑6-MP治療后發(fā)現(xiàn)6-MP可呈劑量依賴性抑制糖尿病誘導(dǎo)胸主動(dòng)脈NF-κB p65，Cylin D1水平增加，同時(shí)斑塊周圍細(xì)胞增生層變薄，斑塊底增生組織減少，斑塊面積降低，說明TR3受體激動(dòng)后可降低糖尿病誘導(dǎo)胸主動(dòng)脈NF-κB p65、Cylin D1，減少斑塊周圍細(xì)胞增生，且這種作用可能是TR3受體通過調(diào)控NF-κB p65、Cylin D1表達(dá)抑制動(dòng)脈斑塊的形成，減少動(dòng)脈硬化的發(fā)生。即往大量研究認(rèn)為動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展與平滑肌層泡沫細(xì)胞形成過程平滑肌細(xì)胞增生起至關(guān)重要作用[16]。近年來，有學(xué)者通過相關(guān)研究認(rèn)為在早期動(dòng)脈粥樣硬化抑制平滑細(xì)胞增生可阻止或延緩冠心病的發(fā)展[17]。有研究體外細(xì)胞試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)抑制平滑肌細(xì)胞NF-κB p65，Cylin D1可降低平滑肌細(xì)胞增殖遷移[18]。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TR3受體激動(dòng)劑6-MP抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能是通過降低糖尿病ApoE-/-小鼠血糖水平，改善血脂代謝，降低胸主動(dòng)脈NF-κB p65、Cylin D1表達(dá)。