周慶峰，康潔，馬亢，張雁冰

（1.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南商丘476000；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450006）

多糖是一種由多個(gè)單糖聚合生成的高分子碳水化合物，其糖基組成為葡萄糖、半乳糖及甘露糖，具有免疫增強(qiáng)、抗衰老、降血脂等多種功能，亦是制備功能保健食品的優(yōu)質(zhì)原料[1-2]。

山藥為薯蕷科植物薯蕷的塊莖，是我國(guó)傳統(tǒng)藥食同源保健食品之一，山藥多糖是山藥的主要活性成分，具有提高機(jī)體免疫、抗衰老、抗突變、抗氧化、抗腫瘤和降血糖等功能[3-4]。

急性酒精中毒是指人在短時(shí)間內(nèi)大量飲酒后導(dǎo)致神經(jīng)中樞系統(tǒng)興奮及隨后進(jìn)入的抑制狀態(tài)。輕者可見(jiàn)煩躁多語(yǔ)、惡心嘔吐，重者可導(dǎo)致昏迷、呼吸緩慢、體溫下降，嚴(yán)重影響人的身體機(jī)能[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖解酒效果已有較為廣泛的研究，如玉郎傘多糖、枳椇子多糖、麥冬多糖、石斛多糖等均已證明能夠延長(zhǎng)醉酒潛伏期，抑制氧自由基的釋放，延緩酒精在腸胃的吸收等作用，進(jìn)而起到保肝、護(hù)肝和解酒作用[6-9]。那么山藥多糖是否也具有解酒保肝作用，目前還未見(jiàn)明確報(bào)道。因此，在本研究中，首先建造小鼠急性酒精中毒模型，通過(guò)觀察給藥后醉酒小鼠入睡潛伏期和醉酒時(shí)間，以及測(cè)定血清和肝組織中反應(yīng)肝功能的生化指標(biāo)的變化，來(lái)探索山藥多糖的解酒護(hù)肝作用，明確其解酒防醉效果，為開(kāi)發(fā)新的解酒藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康小鼠，體重20 g～30 g，均為清潔動(dòng)物，檢疫合格，自由飲水，由商丘師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為 40%～60%，明暗交替周期為12 h。

1.1.2 藥品

山藥選自河南省商丘市孫付集鄉(xiāng)出產(chǎn)的鐵棍山藥；山藥多糖為本校功能食品研發(fā)實(shí)驗(yàn)室制備，收率為0.31%；56°白酒（選自紅星牌二鍋頭）：北京紅星酒業(yè)有限公司；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，AST）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 器材

Agilent 7890A 氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；JJ-2 組織搗碎勻漿機(jī)：常州國(guó)華電器有公司；小鼠灌胃器：北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。

1.1.4 藥品配置

1）山藥多糖制備。采用水提法制備山藥多糖，其工藝條件為：山藥粉過(guò)篩目數(shù)80 目、提取溫度55 ℃、料液比 1 ∶30（g/mL）、提取時(shí)間 4.0 h，獲得山藥粗多糖。為進(jìn)一步除去蛋白質(zhì)，采用氯仿∶正丁醇為4 ∶1（體積比）的Sevage 試劑與多糖提取液按4 ∶1（體積比）混合，振搖20 min 后，在4 000 r/min 下離心10 min，分去水層與溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)提取2 次～5 次，沉淀干燥后備用[10]。

2）山藥多糖含量檢測(cè)。取不同濃度的甘露糖溶液，用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取25 mg的山藥粗多糖，按同樣的操作方法，測(cè)定其吸光度值，用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其多糖含量[11]。

1.2 方法與觀察指標(biāo)

1.2.1 小鼠醉酒模型的建立

選取75 只昆明小鼠，實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物禁食12 h，將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組15 只，分別按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/10 g 體重灌胃56°紅星二鍋頭。灌胃后小鼠立即放在垂直的鐵絲網(wǎng)上，通過(guò)記錄攀附時(shí)間、耐受時(shí)間、醉酒時(shí)間、醉酒率、死亡率，取醉酒率最高而小鼠死亡率較低的劑量進(jìn)行小鼠急性酒精中毒實(shí)驗(yàn)[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用0.4 mL/10 g 體重的酒精灌胃劑量能使實(shí)驗(yàn)小鼠的醉酒率最高，同時(shí)死亡率最低，因此選擇此劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳醉酒劑量。

1.2.2 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠耐受時(shí)間和醉酒時(shí)間的影響

取小鼠60 只，雌雄各半，隨機(jī)分為4 組，分別為山藥多糖高、中、低劑量組（0.8、0.4、0.2 g/kg 體重）和生理鹽水對(duì)照組，每組10 只，禁食12 h 后，進(jìn)行稱重并記錄。先分別灌胃給予低、中、高劑量的山藥多糖和生理鹽水，30 min 后按0.4 mL/10 g 體重的酒精劑量給予白酒灌胃，獲得醉酒小鼠（小鼠醉酒與否以翻正反射是否消失為標(biāo)準(zhǔn)，小鼠灌胃后將其背向下，輕放入鼠籠，若小鼠背向下的姿勢(shì)保持30 s 以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒）。在排除灌胃后立即死亡及3 h 以上仍未出現(xiàn)醉酒狀態(tài)的小鼠后，觀察記錄小鼠從給酒后到出現(xiàn)翻正反射消失（即出現(xiàn)醉酒）的時(shí)間，比較各組小鼠醉酒時(shí)間和醒酒時(shí)間（小鼠復(fù)蘇的判斷標(biāo)準(zhǔn)為醉酒小鼠翻正反射恢復(fù)，并且行動(dòng)靈活自如，毛滑順）[13]。

1.2.3 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠血液乙醇和乙醛濃度的影響

取小鼠60 只，按1.2.2 所述方法分組給藥后，按照1.2.1 所述的醉酒模型建立方法給予酒精灌胃。灌胃1.5 h 后，摘小鼠眼球取血，分離血清，根據(jù)參考文獻(xiàn)方法，采用氣相色譜法測(cè)定血清中乙醇和乙醛的濃度[14]。

1.2.4 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠肝臟部分生化指標(biāo)的影響

取血后，將小鼠采用頸椎脫臼法處死，取肝臟并用濾紙吸凈肝臟表面水分和血液后用9 倍質(zhì)量的生理鹽水制成10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的勻漿液，4 ℃下離心15 min（3 000 r/min），取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、乙醇脫氫酶（ADH）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量[15-16]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。與對(duì)照組相比，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，表示差異非常顯著，P>0.05，表示無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠醉酒模型的建立

小鼠醉酒模型見(jiàn)表1。

表1 小鼠醉酒模型的建立Table 1 Establishment of drunkenness model in mice

當(dāng)給酒量在0.1 mL/10 g～0.5 mL/10 g 范圍內(nèi)時(shí)，隨著給酒量的增加，小鼠的醉酒時(shí)間、醉酒率和死亡率都明顯升高，耐受時(shí)間降低；其中0.4 mL/10 g 和0.5 mL/10 g 灌酒組醉酒率均達(dá)到100%，小鼠表現(xiàn)為后腹拖地，翻正反射消失。相比之下，0.5 mL/10 g 灌酒組有5 只小鼠死亡，醉酒致死率最高；而0.4 mL/10 g灌胃組只有1 只小鼠死亡，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)確定0.4 mL/10 g 為建立小鼠醉酒模型的劑量。

2.2 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠醉酒潛伏期和醉酒時(shí)間的影響

山藥多糖對(duì)醉酒小鼠醉酒潛伏期和醉酒時(shí)間的影響見(jiàn)表2。

表2 山藥多糖對(duì)小鼠醉酒潛伏期和醉酒時(shí)間的影響Table 2 Effects of rhizoma dioscoreae polysaccharide on the drunked latency and sleeping time of drunk of mice

與模型組相比，山藥多糖低劑量組既能增加小鼠醉酒耐受時(shí)間和減少醉酒時(shí)間（P<0.05）。山藥多糖中、高劑量組的醉酒潛伏期顯著延長(zhǎng)，醉酒維持時(shí)間顯著縮短（P<0.01）。

2.3 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠血液生化指標(biāo)的影響

山藥多糖對(duì)醉酒小鼠血清乙醇和乙醛濃度的影響情況見(jiàn)表3。

表3 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠血清乙醇和乙醛濃度的影響Table 3 Effects of rhizoma dioscoreae polysaccharide on serum alcohol and acetaldehyde content

采用氣相色譜法對(duì)醉酒小鼠血清中乙醇和乙醛的濃度進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，與模型組相比，山藥多糖低劑量組既能降低醉酒小鼠血清中乙醇（P<0.05），山藥多糖中、高劑量組降低乙醇濃度更為顯著（P<0.01）；與模型組相比，山藥多糖各劑量組均能顯著降低醉酒小鼠血清乙醛濃度（P<0.01）。

2.4 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

山藥多糖對(duì)醉酒小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表4。

AST 和ALT 是臨床上判斷是否存在肝功能異常的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的ALT 和AST 活性顯著升高（P<0.01），說(shuō)明酒精對(duì)肝功能造成了一定的損害。而與模型組比較，低、中、高3個(gè)山藥多糖給藥組血清中ALT 和AST 活性降低明顯（P<0.01），表明山藥多糖對(duì)急性酒精中毒引起的肝細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。SOD 活性和ADH 活性也是評(píng)價(jià)肝臟功能的重要生化指標(biāo)，在我們?cè)囼?yàn)中，3種劑量的山藥多糖還能夠顯著增高肝組織中SOD 活性和ADH 活性（P<0.01）；進(jìn)一步提示山藥多糖可以預(yù)防急性酒精中毒造成的小鼠肝損傷氧化應(yīng)激情況，對(duì)小鼠的肝臟起到保護(hù)作用。數(shù)據(jù)顯示，山藥多糖低劑量組既能較好的起到降低ALT 和AST 活性、升高SOD 和ADH 活性效應(yīng)（P<0.05），與低劑量給藥組相比，山藥多糖中、高劑量組降低ALT 和AST、升高SOD和ADH 活性的能力更加顯著（P<0.01）。

表4 山藥多糖對(duì)醉酒小鼠肝臟AST、ALT、ADH 和SOD 活性的影響Table 4 Effects of rhizoma dioscoreae polysaccharide on AST，ALT，ADH and SOD activity in liver of drunk mice

3 結(jié)論與討論

急性酒精中毒是酒精服用過(guò)量后引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙狀態(tài)。當(dāng)飲酒過(guò)量時(shí)，機(jī)體已經(jīng)無(wú)法對(duì)乙醇進(jìn)行有效分解，導(dǎo)致大量的乙醇經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入大腦并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而產(chǎn)生惡心、嘔吐、甚至神志不清等一系列不良反應(yīng)。

乙醇脫氫酶（ADH）是乙醇代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活力水平?jīng)Q定乙醇代謝能力的高低[17]。另外，過(guò)量飲酒會(huì)在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞造成不同程度的損傷。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要酶之一，可通過(guò)清除體內(nèi)的超氧陰離子來(lái)阻斷過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的攻擊。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性變化是肝細(xì)胞受損的間接標(biāo)志，當(dāng)酒精造成肝細(xì)胞損傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜被破壞，同時(shí)細(xì)胞通透性增加，使肝細(xì)胞中的ALT 與AST 滲入血液進(jìn)而引起血清中的活性升高，因此臨床上常用于肝功能水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]。

山藥多糖是山藥最重要的功能組分，已被證明具有抗氧化、提升免疫、降低血糖等多種功能活性[19]。在研究中，發(fā)現(xiàn)山藥多糖可通過(guò)影響乙醇代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化等多種途徑產(chǎn)生肝細(xì)胞保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，山藥多糖能顯著延長(zhǎng)醉酒耐受時(shí)間，縮短睡眠時(shí)間，降低乙醇和乙醛質(zhì)量濃度，進(jìn)而對(duì)醉酒小鼠急性酒精中毒產(chǎn)生一定的解毒作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，山藥多糖對(duì)急性酒精中毒小鼠具有較為顯著的解酒作用，在保護(hù)酒精造成的肝臟功能損傷方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值。盡管本研究已經(jīng)證明了山藥多糖的解酒功效，但山藥多糖解酒作用的具體機(jī)制，以及是否能與葛根、枳椇子等經(jīng)典的解酒護(hù)肝藥材產(chǎn)生協(xié)同解酒作用，目前仍不明確。有報(bào)道稱葛根可通過(guò)影響白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-6 和抑制一氧化氮蛋白表達(dá)，來(lái)抑制酒精代謝產(chǎn)生的炎性變化[20-21]，山藥多糖是否也是通過(guò)這些細(xì)胞因子來(lái)產(chǎn)生解酒抗炎作用，仍需要在進(jìn)一步研究中加以探索。