楊 坤 趙謀明 孫為正 趙強忠 林戀竹

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510640）

海參屬棘皮動物門、海參綱[1]，是海洋中最常見的無脊椎動物。據(jù)報道，全世界已發(fā)現(xiàn)的海參大約有1 100種，其中40種可供食用；我國總計約有100種，其中約20種可供食用[2]。新鮮海參體內(nèi)含有活性很強的自溶酶[3]，在受到外界物理因素、化學(xué)因素和生理因素等刺激后，原本正常的生命活動出現(xiàn)紊亂，會發(fā)生吐腸和體壁軟化的現(xiàn)象[4]，在捕獲后需快速進行干制處理。市場上流通量最大的海參制品為干制海參，約占到市場上海參制品量的90%[5]。

海參具有高蛋白、低脂肪的特點[6]。海參中豐富的蛋白、多糖和皂甙，是其發(fā)揮抗衰老、抗腫瘤、提高機體免疫力和降血脂等多種生理功效的主要活性物質(zhì)[7]。其中，膠原蛋白是海參中含量最多的活性物質(zhì)，占海參蛋白的70%以上[8]。中國產(chǎn)刺參膠原蛋白中甘氨酸和羥脯氨酸含量較多，酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸含量較低，與人Ⅰ型膠原蛋白的氨基酸組成相近，生物利用度較高[9-12]。海參多糖是海參體壁中含量僅次于蛋白質(zhì)的另一重要成分，其分為兩種：一種為硫酸軟骨素，為分支雜多糖，另一種是巖藻聚糖，為直鏈多糖。二者均有較高含量的硫酸酯質(zhì)，約占其總質(zhì)量的30%[13-16]。

本文在前人研究的基礎(chǔ)上，以小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其長崎參、大連大烏參、澳洲參為研究對象，采用3種蛋白酶——復(fù)合蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別水解4，8，12 h，制備得到海參提取物，采用還原力、羥自由基清除能力、氧自由基吸收能力評價法對比研究其抗氧化活性，為以海參提取物為核心配料的功能性食品的加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 原料

小北極海參、大北極海參、葉瓜參、花刺參、土耳其參、大連大烏參、澳洲參，采購自廣州市一德路干貨批發(fā)市場，置于陰涼干燥處備用。

1.2 試劑

復(fù)合蛋白酶（酶活為46 000 U/g），風味蛋白酶（酶活為40 000 U/g），購于丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶（酶活為56 000 U/g），購于廣州裕立寶生物科技公司；AAPH，熒光素，trolox，純度為 99%，購于美國Sigma公司；其它試劑均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠；去離子水，實驗室自制。

1.3 設(shè)備

絞肉機（MM12），廣東省韶關(guān)市食品機械廠；pH計（PHS-2F），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；阿貝折光儀（E-line），香港德祥科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-S1），金壇華特實驗儀器有限公司；分析天平（AL204），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；烘箱（101-3A），上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；酶標儀（Varioskan Flash），美國Thermo公司；紫外分光光度計（UV-721），上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；恒溫振蕩器（THZ-82A），常州澳華儀器有限公司；離心機（ST-16R），美國Thermo公司；自動定氮儀（KND-103F），上海纖檢儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 海參提取物酶法制備工藝研究 分別取干海參各 200 g，按料液比 1∶20（m/m）加入去離子水，15℃泡發(fā)48 h，冷水漂洗2次，瀝干多余的水分，稱重后，計算泡發(fā)增重倍數(shù)，然后使用絞肉機絞碎海參，成肉糜狀，分別取海參肉糜各15 g，按料液比為1∶2（m/m）加入去離子水，分別加入肉糜質(zhì)量0.1%的酶（復(fù)合蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶），分別于55℃酶解4，8和12 h，95℃加熱15 min，4 000 g離心 20 min，取上清液，得海參提取物。考察海參種類、酶的種類、酶解時間對海參提取物得率、蛋白回收率以及抗氧化活性的影響。

1.4.2 泡發(fā)增重倍數(shù)測定 取m1質(zhì)量的干海參進行泡發(fā)，泡發(fā)完成后瀝干水分計重，質(zhì)量為m2。

1.4.3 海參提取物得率的測定 取m3質(zhì)量的海參肉糜進行酶解，海參提取物計重m4，使用阿貝折光儀測定提取物中固形物含量（b）。

1.4.4 蛋白回收率的測定[17]采用凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）測定提取物中總氮量。

式中：N1——海參提取物總氮量，g；N2——原料總氮量，g。

1.4.5 海參提取物的還原力評價[18]取2 mL樣品，依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2 mL 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃保溫 20 min后，加入 2 mL 10%（w/v）的 TCA，混勻，4 000 g離心 10 min，取上清液 2 mL，依次加入2 mL蒸餾水以及 0.4 mL 0.1%（w/v）氯化鐵溶液，混勻，室溫反應(yīng)10 min后，測定其在700 nm 處的吸光度值。將trolox作為標準品，trolox濃度與其吸光度值呈線性關(guān)系，換算得到樣品的還原力值，即達到每克干海參的還原力所需trolox的量（μmol trolox當量/g干海參），還原力值越大，樣品的還原力越強。

1.4.6 海參提取物的羥基自由基清除能力評價[19-20]羥基自由基（OH）清除力的測定選用鄰二氮菲法。樣品管：取0.6 mL樣品溶液，加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4），混勻，依次加入0.6 mL鄰二氮菲溶液（5 mmol/L）及0.6 mL EDTA（15 mmol/L），混勻后，加入 0.6 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），充分混勻后加入0.8 mL 0.1%（V/V）H2O2。搖勻后于37℃保溫1 h，測定其在536 nm 處吸光值 A536（樣品）；損傷管：以去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管，所測吸光值為 A536（損傷）；未損傷管：以去離子水代替H2O2，其余步驟同損傷管，所測吸光值為 A536（未損傷）。

將trolox作為標準品，trolox濃度與其OH清除率呈線性關(guān)系，換算得到樣品的OH值，即達到每克干海參的OH清除能力所需Torlox的量（μmol trolox當量/g干海參），OH值越大，樣品的OH清除能力越強。

1.4.7 海參提取物的氧自由基吸收能力（ORAC）評價[21]在96孔熒光板各微孔中分別加入20 μL待測樣品或磷酸鹽緩沖液（75mmol/L，pH7.4），添加70 nmol/L熒光素120 μL，在37℃下保溫 15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入60 μL 12 mmol/L AAPH啟動反應(yīng)，并將微孔板置于酶標儀中，保持反應(yīng)體系溫度恒定為37℃，設(shè)定激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm，開始計時反應(yīng)并讀數(shù)（f0），每 1 min測定 1次，共讀 121次數(shù)（共計反應(yīng)120 min），將每次讀數(shù)連成曲線。Q表示曲線下的面積。

Q=0.5（f0+fn）+（f1+f2+…+fi+…+fn-1）

L=Q樣品-Q空白

將trolox作為標準品，trolox濃度與其L呈線性關(guān)系，換算得到樣品的ORAC值，即達到每克干海參的氧自由基吸收能力所需Torlox的量（μmol trolox當量/g干海參）。

1.4.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件中的ANOVA方法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析，以P<0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±s）的形式來表示。聚類分析采用SPSS 17.0軟件中的系統(tǒng)聚類的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)

7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)如表1所示。

表1 7種海參蛋白含量及泡發(fā)增重倍數(shù)Table 1 Protein contents and soaked mulriples of seven kinds of sea cucumbers

試驗結(jié)果表明：7種干海參經(jīng)冷水泡發(fā)后，土耳其參增重倍數(shù)最高（3.24）。大連大烏參蛋白含量最高，達到60.62%。海參中最重要且含量最高的營養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)，由于干海參制作時會添加大量的鹽，致使干海參中蛋白含量有所降低。不同等級、種類海參在鹽干時，加入的鹽含量不同，因此，不同干海參蛋白含量差異較大。

2.2 不同酶、酶解時間對7種海參提取物得率、蛋白回收率的影響

2.2.1 不同酶、酶解時間對7種海參提取物得率的影響 不同酶、酶解時間對7種海參提取物得率的影響如圖1所示。

圖1 酶解4，8，12 h不同酶對海參提取物得率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the sea cucumber extract yields in enzymolysis for 4，8，12 h

試驗結(jié)果表明：3種酶酶解海參4 h時，7種海參提取物得率為17.68%～55.57%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大連大烏參，其提取物得率最高，達到55.57%。對于7種海參，以土耳其參、小北極海參提取物得率較高，分別為38.3%～52.9%和38.17%～42.53%。對于3種蛋白酶，采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參，所得海參提取物得率最高。此外，采用木瓜蛋白酶酶解大連大烏參、葉瓜參、花刺參和大北極海參時，所得海參提取物得率顯著高于采用風味蛋白酶酶解這4種海參所得海參提取物得率（P<0.05）。然而，采用木瓜蛋白酶酶解土耳其參、澳洲海參和小北極海參時，所得海參提取物得率與采用風味蛋白酶酶解這3種海參所得海參提取物得率沒有顯著性差異（P＞0.05）。當采用3種酶酶解海參8 h時，7種海參提取物得率為22.17%～57.76%，相對于酶解4 h時海參提取物得率有一定程度的提高，但提高幅度不大。3種酶酶解海參12 h時，7種海參提取物得率介于21.57%～61.64%之間，相對于酶解4，8 h時海參提取物得率有一定程度的提高。

2.2.2不同酶、酶解時間對7種海參蛋白回收率的影響 蛋白質(zhì)是海參中含量最高的營養(yǎng)成分。因此，蛋白肽是海參提取物中最主要的成分，對海參提取物的活性有重要的貢獻。不同酶、酶解時間對7種海參蛋白回收率的影響如圖2所示。

圖2 酶解4，8，12 h時7種海參蛋白回收率Fig.2 Protein recovery rates of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

試驗結(jié)果表明：當采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風味蛋白酶酶解不同海參4 h時，7種海參的蛋白回收率為22.89%～96.48%。其中，采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時，蛋白回收率最高，達到96.48%。對于3種蛋白酶，采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時，蛋白回收率最高，木瓜蛋白酶次之，而采用風味蛋白酶酶解7種海參時，蛋白回收率最低。

當酶解時間延長至8 h時，7種海參的蛋白回收率為29.18%～97.56%。采用復(fù)合蛋白酶酶解7種海參時，蛋白回收率最高，其中以大北極海參酶解產(chǎn)物蛋白回收率為最高，木瓜蛋白酶次之，風味蛋白酶最低。采用3種不同酶酶解小北極海參時，蛋白回收率沒有顯著性差異（P＞0.05）。

當酶解時間延長至12 h時，7種海參的蛋白回收率為28.56%～98.40%。采用復(fù)合蛋白酶酶解大北極海參時，蛋白回收率最高。3種蛋白酶酶解效率從高到低依次是：復(fù)合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞風味蛋白酶。采用3種不同酶酶解小北極海參時，蛋白回收率沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.3 7種海參提取物得率、蛋白回收率聚類分析 以海參提取物得率和蛋白回收率為指標，對不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進行了聚類分析，一共分為5類，結(jié)果表明：（1）土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高，較易酶解；（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率和蛋白回收率最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風味蛋白酶；（3）使用復(fù)合蛋白酶酶解澳洲海參和葉瓜參時，增加酶解時間有利于蛋白肽的提取。對于土耳其海參、大連大烏參和大北極海參，使用復(fù)合蛋白酶酶解時，增加酶解時間不會顯著提高其提取物得率與蛋白回收率；（4）對于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參和花刺參，使用木瓜蛋白酶進行酶解時，增加酶解時間有利于蛋白肽的提取。而對于葉瓜參、小北極海參和大北極海參，增加酶解時間不會顯著提高其提取物得率和蛋白回收率；（5）對于葉瓜參和大北極海參，增加酶解時間有利于蛋白肽的提取。而對于土耳其參、大連大烏參、澳洲海參、花刺參和小北極海參，使用風味蛋白酶進行酶解，延長酶解時間不會顯著提高其提取物得率和蛋白回收率。

2.3 不同酶、酶解時間對7種海參提取物抗氧化活性的影響

2.3.1 不同酶、酶解時間對7種海參提取物還原力的影響 7種海參的還原力值如圖3所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的還原力值具有顯著性差異（P＜0.05）?？偟恼f來，土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的還原力值相對較高，其余種海參提取物還原力值較低。

圖3 酶解4，8，12 h時7種海參提取物的還原力值Fig.3 Reducing power values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

具體說來，當采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風味蛋白酶酶解不同海參4 h時，7種海參提取物的還原力值為3.34～13.86 μmol trolox當量/g干海參，其中，風味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高，達到13.86 μmol trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至8 h時，7種海參提取物的還原力值為2.91～13.47 μmol trolox當量/g干海參，其中，風味蛋白酶酶解土耳其海參所得提取物的還原力值最高，達到13.47 μmol trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至12 h時，7種海參提取物的還原力值為4.21～15.98 μmol trolox當量/g干海參，其中，風味蛋白酶酶解澳洲海參所得提取物的還原力值最高，達到15.98 μmol trolox當量/g干海參。

2.3.2 不同酶、酶解時間對7種海參提取物羥自由基清除能力的影響 7種海參提取物的OH值如圖4所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的OH值具有顯著性差異（P<0.05）。總體來說，葉瓜參提取物的OH值最高，明顯高于其他6種海參提取物。土耳其參、大連大烏參和澳洲海參提取物的OH值相對較低。

具體來說：采用3種酶酶解4 h時，7種海參提取物的OH值為17.39～99.06 μmol trolox當量/g干海參，其中，木瓜蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達到99.06 μmol trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至8 h時，7種海參提取物的OH值為25.42～128.8 μmol trolox當量/g干海參，其中，風味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達到128.8 μmol trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至12 h時，OH值變化范圍為27.29～148.43 μmol trolox 當量/g 干海參，其中，風味蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物OH值最高，達到148.43 μmol trolox當量/g干海參。結(jié)果顯示，延長酶解時間有利于海參提取物羥自由基清除能力的提高。

2.3.3 不同酶、酶解時間對7種海參提取物氧自由基吸收能力的影響

圖4 酶解4，8，12 h時7種海參提取物的OH值Fig.4 OH values of seven kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

7種海參提取物的ORAC值如圖5所示。不同海參經(jīng)3種蛋白酶解，所得提取物的ORAC值具有顯著性差異（P<0.05）。與其它海參提取物相比，花刺參提取物的ORAC值較低。采用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物的氧自由基吸收能力最強，其次是木瓜蛋白酶，再次是風味蛋白酶。

圖5 酶解4，8，12 h時7種海參提取物的ORAC值Fig.5 ORAC values of 7 kinds of sea cucumbers in enzymolysis for 4，8，12 h

結(jié)果顯示：當采用木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶以及風味蛋白酶酶解不同海參4 h時，7種海參提取物的 ORAC值為 15.4～99.93 μmol trolox當量/g干海參，其中復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高，達到99.93 μmol Trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至8 h時，7種海參提取物的ORAC值為24.2～133.08 μmol trolox當量/g干海參，相對于酶解4 h所得海參提取物的ORAC值有顯著提高（P<0.05），其中，復(fù)合蛋白酶酶解葉瓜參所得提取物ORAC值最高，達到133.08 μmol trolox當量/g干海參。當酶解時間延長至12 h時，7種海參提取物的ORAC值為19.99～110.2 μmol trolox當量/g干海參，相對于酶解8 h所得海參提取物的ORAC值有顯著降低（P<0.05），其中，復(fù)合蛋白酶酶解土耳其參所得提取物ORAC值最高，達到110.2 μmol trolox當量/g干海參。因此，適當延長酶解時間有利于海參提取物氧自由基吸收能力的提高，但酶解時間過長，會降低海參提取物氧自由基吸收能力。

2.3.4 7種海參提取物抗氧化活性聚類分析 以還原力值、ORAC值、OH值為指標，對不同酶解條件下所制得的63種海參提取物進行了聚類分析，可以分為7類。結(jié)果顯示：（1）葉瓜參提取物的抗氧化能力最強，小北極海參提取物次之，其余海參較差；（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風味蛋白酶；（3）隨著酶解時間的延長，葉瓜參、花刺參、大/小北極海參提取物的抗氧化活性均有所提高；而土耳其海參、大連大烏參和澳洲海參提取物的抗氧化活性隨酶解時間延長變化不大。

3 結(jié)論

本文以7種常見的低值可食用海參為研究對象，采用3種蛋白酶：復(fù)合蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶，分別水解4，8，12 h，制備得到海參提取物，評價其抗氧化活性，結(jié)果表明：

（1）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物得率、蛋白回收率最高，其次是木瓜蛋白酶，最次是風味蛋白酶；7種海參提取物得率為41.24%～55.57%，蛋白回收率為65.06%～98.4%。

（2）使用復(fù)合蛋白酶所制備的海參提取物抗氧化活性最強，其次是木瓜蛋白酶，最次是風味蛋白酶；7種海參提取物還原力值為3.41～8.34 μmol trolox當量/g干海參，OH值為 28.83～96.65 μmol trolox當量/g干海參，ORAC值為 38.99～133.08 μmol trolox當量/g干海參；葉瓜參提取物的抗氧化活性最強，小北極海參提取物次之，其余海參提取物較差。

（3）土耳其海參、大連大烏參、澳洲海參、葉瓜參和大北極海參提取物得率及蛋白回收率高，較易酶解；葉瓜參提取物的抗氧化活性最強，可作為具有強抗氧化活性的食品配料應(yīng)用于功能性食品。