熊 科 崔曉亭 王小藝 趙峙堯 柳佳蕓 裴鵬剛 鄧 蕾 熊蘇玥

（1北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京 100048

2北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048

3北京工商大學 北京市質量與安全重點實驗室 北京 100048

4北京工商大學 北京市風味化學重點實驗室 北京 100048）

我國是農業(yè)大國，伴隨著農產品生產加工，每年產生大量農業(yè)廢棄物。這些農業(yè)廢棄物資源再生利用率極低，大部分被浪費[1-2]。大力開發(fā)利用這些資源可以緩解環(huán)境、資源和糧食危機，因此農業(yè)廢棄物再利用成為近十幾年各國研究的熱點[3]。木聚糖是結構比較復雜的半纖維素，為世界第二大可再生資源[4]。由于木聚糖結構復雜，它的徹底水解需要一系列酶的協同作用，其中最關鍵的酶是木聚糖酶[5]。在眾多應用中，以木聚糖經酶法制取有較高附加值的功能低聚糖，是富含半纖維素材料的農業(yè)廢棄物再生利用的有效增值途徑，具有巨大的潛在經濟效益和環(huán)保意義[6-8]。而木聚糖酶屬水解酶類，在碳循環(huán)過程中發(fā)揮了不可替代的功能，具有重要的潛在應用價值，目前已成功應用于食品、飼料、釀造、造紙、醫(yī)藥和能源等領域[9-11]。

目前，多數木聚糖酶來源于各類天然微生物菌株，通過天然產酶方式獲得的木聚糖酶多為復合酶，表達量低，且不易純化[12]。由于自然界中99%以上的微生物是不能被純培養(yǎng)利用，因此該方法得到的產木聚糖酶菌株十分有限，僅局限于不到1%的微生物基因資源，對自然界中所占比例較大的非培養(yǎng)微生物資源無法利用[13]。近年來，越來越多的學者基于宏基因組的方法篩選木聚糖酶。如汪國增等[14]通過構建瘤胃宏基因組文庫，從中篩選到酶學性質較為新穎的木聚糖酶，其最適作用溫度30℃，可用于果汁的澄清，生產飼料等工業(yè)。張鵬等[15]從堆肥構建的宏基因組文庫中篩選到性質較為優(yōu)良的纖維素酶和木聚糖酶，可用于造紙等工業(yè)。Bao等[16]從牦牛瘤胃等宏基因文庫中篩選到能提高木聚糖酶活力的纖維素酶，可用于食品加工，動物飼料的加工。Hu Y等[17]從土壤宏基因文庫中篩選到一種低溫耐堿酶，與常規(guī)木聚糖酶不同，可用于制備生物燃料、燃料乙醇。GonX等[18]從牛瘤胃等中篩選到無纖維素酶活力的木聚糖酶，可用于紙漿漂白等工業(yè)化應用。Mo XC等[19]從土壤宏基因組文庫中篩選到一種多功能酶，能夠制備低聚木糖。從來源上比較，木聚糖酶廣泛來源于各種環(huán)境，如海洋、陸地等。而土壤微生物是木聚糖酶的巨大來源庫，通常每1 g土壤中有幾億到幾百億個微生物，雖然土壤宏基因文庫構建面臨的干擾因素多、難點大，如腐殖酸的去除等，但構建土壤未培養(yǎng)微生物的宏基因組文庫能更廣泛地獲得木聚糖酶優(yōu)良基因資源。本研究以土壤環(huán)境作為宏基因來源對酶進行發(fā)掘，相比其它環(huán)境的宏基因來源可大大提高尋找和發(fā)現新木聚糖酶基因的概率，理論意義和潛在的應用價值較大。利用HiTAIL-PCR將獲得非培養(yǎng)的木聚糖酶基因全長進行異源表達，為更好地開發(fā)利用土壤未培養(yǎng)微生物資源，發(fā)掘新穎的木聚糖酶資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品來自云南、貴州、河南、河北等15個地區(qū)。樣品采用鐵鏟采集，用刮刀除去5 cm厚的表層土。將采集的土壤樣品保存于無菌塑料袋中，于-4℃冰箱保存待用。

1.2 主要試劑

DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國OMEGA）；瓊脂糖（西班牙 Biowest）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基磺酸鈉（SDS）購自上海生工生物技術有限公司；RNA酶，蛋白酶K來自（日本 TAKARA）；Sau 3A I、BamH I、CIAP、T4 DNA 連 接 酶 、Q5 DNA 聚 合 酶 、λDNA/Hind III、DL2000、1 kb PlusDNA Ladder，pUC19、E.coli DH5、pET28a 載體、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞（日本TAKARA）；氨芐霉素（Amp）蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）（英國 Oxford公司）；Gel Exraction Kit（美國 OMEGA）；剛果紅，卡那霉素（美國 AMRESCO）；櫸木木聚糖（美國 Sigma）。

1.3 主要設備與儀器

DYC P-31BN水平電泳槽、DYY-10C電泳儀，北京六一儀器廠；Image Quant 300凝膠成像儀、Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器，美國 GE公司；Sigma 1-14小型臺式高速離心機，美國 Sigma公司；WD-9405B型水平搖床，北京六一；PCR儀，Biometra，德國；ImageQuant 300 凝膠成像儀，Multitemp III恒溫循環(huán)水浴器，美國GE；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；DHZ-DA全溫振蕩器，江蘇太倉培英；WD-9405B型水平搖床，北京六一；Nanodrop核酸定量儀，Thermo公司。

1.4 土壤宏基因組文庫構建

每次稱取80 g土壤，用提取緩沖液（Tris-HCl：100 mmol/L pH 8.0；EDTA：100 mmol/L，pH 8.0；NaCl：1.5 mol/L；CTAB：1%）溶解稀釋土樣，225 r/min。混勻2～3 h。具體提取方法參照Zhou等[20]。將回收后的DNA片段采用Sau3A I進行部分酶切，并與經BamH I酶切后與pUC19載體進行連接，電轉化法導入到DH5α中。

1.5 土壤宏基因組文庫的篩選

土壤宏基因組文庫的篩選方法參照Kwon等[21]，將文庫中的克隆子轉接到含有0.5%的木聚糖底物的平板上培養(yǎng)24 h，將平板放置在50℃烘箱30 min后，剛果紅染色15 min，1 mol/L的Na-Cl脫色15 min，在底物平板上能產生透明圈的克隆即為陽性克隆。

1.6 木聚糖酶基因cbxynA序列分析

對上述篩選得到的陽性克隆子提取質粒并測序，用在線軟件預測外源插入片段所有可能的開放閱讀框，用DNAMAN預測目的基因可能的分子質量和等電點。

1.7 重組酶CBXYNA的表達和純化

利用Primer5軟件設計引物，擴增cbxynA的ORF編碼序列。在序列 N端正（5’-CATGCCATGGCACACGTACACGTCCCG-3’）引入Xho I位點，在C端（5’-CCGCTGAGGCAGGCTGCGAAAAGCCC-3’）引入 Nco I位點。

將目的基因cbxynA經Xho I和Nco I雙酶切后連接到pET-28a（+）載體并轉化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中進行異源表達。對表達過程中何時加入IPTG的誘導時機、加入IPTG誘導后的溫度、誘導的時間及IPTG濃度等參數進行優(yōu)化。收集菌體后用裂解液裂解，超聲波破碎細胞后離心收集上清粗酶液。用Ni柱純化粗酶液，先用2.5%wash&elution buffer對柱料進行沖洗，通過A280檢測器對除雜蛋白情況進行監(jiān)控，直至檢測器顯示沒有雜峰的出現。用wash&elution buffer對柱料進行梯度洗脫，梯度分別為5%，10%，20%，40%，60%，80%，100%。并將對應的出峰時間的蛋白進行收集。用SDS-PAGE電泳檢測純化后的酶蛋白。

1.8 重組酶CBXYNA活力及酶學性質測定

以木聚糖為底物，采用DNS法測定酶活力。酶最適pH值和pH穩(wěn)定性測定緩沖液體系為pH值2.2～11。每種緩沖體系5個點，共35個點。重組CBXYNA酶活力的測定在50℃下進行，將常規(guī)方法中的緩沖液替換為上述不同pH體系的緩沖液，測定所得酶活力記為100%。pH穩(wěn)定性是將酶液稀釋，使酶液處于不同的緩沖體系中，50℃下保溫30 min后立即冰浴終止反應，之后按照DNS測定方法測定殘余酶活力，以未經保溫處理的重組木聚糖酶CBXYNA活力為100%，分別計算不同pH下的殘余相對酶活力。

測定最適溫度時，用最適pH緩沖液將酶稀釋一定比例，然后置于40～80℃的不同溫度下，反應10 min，測定酶活力，以最大值為100%。溫度穩(wěn)定性的測定，將樣品與酶最適反應緩沖溶液以一定比例混勻，置于不同溫度（50，55，60，65，70 ℃）中保溫不同時間（0，30 min，1 h，1.5 h，2 h，3 h，4 h，5 h）。定時取樣，測定樣品殘留酶活力，以未處理木聚糖酶活力作對照。

考察的金屬離子 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對 CBXYNA 酶活力的影響。酶對底物特異性的研究，添加1%（w/v）的燕麥木聚糖、樺木木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖在0.05 mol/L，pH 5.2的醋酸緩沖液中，反應時間為10 min，反應溫度為55℃條件下測定木聚糖酶活力。

2 結果與分析

2.1 土壤宏基因組文庫的構建及其篩選

從土壤中提取總的DNA，經純化濃縮后的23 kb以上的DNA的量約為6 μg。因土壤環(huán)境中得到的總DNA片段較長，不利于外源片段插入載體中。故采用Sau3A I酶對回收的土壤DNA片段進行部分酶切，再用1%的瓊脂糖凝膠回收2～10 kb以內的DNA片段約2 μg左右。土壤粗提DNA電泳圖如圖1所示。

將酶切時間設置為1 h，每100 μL加入0.75 U的Sau3A I酶，使得土壤DNA的條帶分布在2～8 kb，符合構建質粒土壤宏基因組文庫。酶切之后的土壤DNA與pUC19載體經T4連接酶連接后，導入到DH5α中。將轉化產物涂布平板后獲得了大量宏基因文庫克隆子。從文庫中隨機提取10個克隆子并提取質粒，用EcoR I和Hind III雙酶切之后，結果表明：質粒間插入的外源酶切帶型差異顯著，文庫克隆片段隨機性較高。外源插入大小為1.5～4.5 kb，平均為 3 kb，粗略計算，宏基因組的庫容量為30 Mb。

圖1 不同方法提取土壤DNA電泳圖Fig.1 Extraction and purification of DNA from soil by different methods

圖2 土壤宏基因組文庫重組質粒雙酶切分析Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmids from the soil metagenomic library

隨后，基于功能策略篩選，采用剛果紅法對文庫進行初篩，Cb5545克隆子在剛果紅平板上的透明圈如圖3所示。

圖3 Cb5545克隆子初篩（a）及復篩（b）選平板中的透明圈Fig.3 Transparent rings of Cb5545 clone in primary screening（a）and screening（b）plate

平板篩選結果表明：克隆子Cb5545具有水解木聚糖底物的活性，使以木聚糖為底物的平板經剛果紅染色后產生了陽性透明圈。隨后對篩選的克隆子進行搖瓶發(fā)酵，取粗酶液采用DNS法測定發(fā)現其初始酶活力為12.09 U/mL。

2.2 基因cbxynA序列分析

將篩選得到的陽性克隆子Cb5545測序，得到一段4 238 bp的DNA序列，并預測了該外源插入片段的所有可能開放閱讀框，其中開放閱讀框ORF10是一個822 bp長的編碼木聚糖酶的完整的開放閱讀框，其編碼產物的氨基酸序列與來自Halobacteriaceae archaeon（古細菌屬）編碼的木聚糖酶的相似度最高也僅為45%，表明該序列是一條未知的新序列（GenBank登記號：KY062986）。該基因編碼的產物由273個氨基酸組成，預測的分子質量為29.1 ku，等電點為5.2。

2.3 重組酶CBXYNA原核表達優(yōu)化

將目的基因cbxynA克隆到pET-28a（+）表達系統里進行異源表達。對重組質粒何時加入IPTG誘導的時機、加入IPTG后的誘導時間、誘導溫度及IPTG濃度進行優(yōu)化。最終的優(yōu)化結果如圖4所示。結果表明：培養(yǎng)5 h后，添加IPTG終濃度為0.7 mmol/L，在23℃下誘導25 h，獲得的最大酶活力為52 U/mL，較初始值提高了4.3倍。

2.4 重組酶CBXYNA的純化

CBXYNA經硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化結果如表1所示。硫酸銨鹽析和Ni-NTA純化后的產物經SDS-PAGE驗證（圖5泳道2），將得到的電泳純級CBXYNA木聚糖酶進行酶學特性研究。

2.5 重組酶CBXYNA酶學性質研究

圖4 IPTG誘導時機的菌體生長曲線（a）及IPTG加入后的誘導時間（b）、誘導溫度（c）及誘導劑濃度（d）對CBXYNA酶活力影響Fig.4 Growth curve of muton for IPTG inducing（a）and Effect of IPTG inducing time（b），temperature（c），concentration（d）on CBXYNA enzyme activity

表1 重組木聚糖酶CBXYNA的純化總結Table 1 Summary of purification recombinant CBXYNA

圖5 CBXYNA純化過程的電泳圖和酶譜圖Fig.5 The SDS-PAGE electrophoresis and zymogram of recombinant CBXYNA

當以木聚糖為底物時，CBXYNA酶促反應的最適pH為5.2（圖6a），其pH穩(wěn)定性在pH 4.2到10.2之間，保溫30 min后殘余酶活仍能達到70%以上（圖6b）。CBXYNA的酶促反應最適溫度為55℃（圖6c），在50～60℃條件下保溫30 min，殘余酶活力仍為80%以上（圖6d）。

研究 Ca2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、K+和Na+、等不同金屬離子對重組木聚糖酶CBXYNA酶活力的影響，由圖7可知，Na+、 K+、Ca2+、Li+在1～7 mmol/L的范圍之內對酶有促進作用，而Mg2+則在1～3 mmol/L內對酶有促進作用，在5～7 mmol/L對酶有抑制作用。Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對酶有抑制作用，且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強。其中，Cu2+對酶的抑制作用最明顯，幾乎使其完全喪失酶活。金屬離子在微生物機體內主要是作為酶活性中心的組成部分，維持生物大分子細胞結構的穩(wěn)定性。但是有些金屬離子對機體有不利影響，研究認為半胱氨酸可以參與糖殘基-酶中間體的形成，而有些重金屬離子阻礙了這一過程，不利于酶促反應的進行，也可能是影響了酶與底物的結合及解離狀態(tài)。然而金屬離子影響酶活力的具體機制還有待于進一步的研究。

進一步探究CBXYNA酶的底物特異性，以樺木木聚糖的酶活力為對照100%，當以水溶性玉米芯木聚糖作為底物時，CBXYNA酶活力達到162%；以燕麥木聚糖為底物時，酶活力為139%。以水不溶性玉米芯為底物時，酶活力為74%；以麩皮為底物時，其酶活力為56%（表2）。

圖6 重組酶CBXYNA的酶學性質Fig.6 Enzymatic properties of the recombinant enzyme CBXYNA

圖7 金屬離子對木聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of metal Ions on xylanase activity

3 結論

研究從土壤宏基因文庫中篩選并鑒定出一個木聚糖酶基因cbxynA，經分析表明該基因是一段未知的新序列。隨后對該基因進行克隆表達，對其原核表達條件進行了優(yōu)化，最終獲得其最大酶活力為52 U/mL，較初始值提高了4.3倍。重組木聚糖酶 CBXYNA，其最適 pH為 5.2，pH在4.2到10.2之間時其酶活力在70%以上，有較好的pH穩(wěn)定性。CBXYNA的最適溫度為55℃，在50～60℃保溫30 min酶活力仍在80%以上，具較好的熱穩(wěn)定性。Na+、K+、Ca2+、Li+在1～7 mmol/L 的范圍之內對酶有促進作用，Mn2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、Cu2+對酶有抑制作用，且抑制作用隨著金屬離子濃度的升高而增強。其中，Cu2+對酶的抑制作用最明顯，幾乎使其完全喪失酶活。當該酶以水溶性玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖、水不溶性玉米芯木聚糖、酶活力分別為162%，139%，74%，說明該CBXYNA更容易結合水解水溶性木聚糖底物。重組木聚糖酶CBXYNA有較好的pH穩(wěn)定性，可用于造紙、飼料、食品等工業(yè)應用中。同時該酶以燕麥木聚糖、水溶性玉米芯木聚糖為底物時，酶活力相對較高，有較強的親和能力，可被用于水解可溶性木聚糖底物制備低聚木糖。

表2 重組CBXYNA對不同水解底物的特異性Table 2 Specificity of CBXYNA towards different hydrolysis substrates