孟凡亮，曹龍龍，焦秋林，李 焱，王宏宇，劉照虎，馬梓承，劉思當(dāng)

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東泰安 271018）

淋巴囊腫病毒（lymphocystis disease virus，LCDV）屬于虹彩病毒科淋巴囊腫病毒屬，是淋巴囊腫病的病原體，可引起全球140 種以上的魚(yú)類患病。淋巴囊腫?。╨ymphocystis disease，LCD）在養(yǎng)殖的海水魚(yú)和淡水魚(yú)中均有發(fā)生，通常與養(yǎng)殖相關(guān)的應(yīng)激條件有關(guān)，但在自由生活的魚(yú)類中也有報(bào)道[1]。LCDV 感染可導(dǎo)致魚(yú)皮膚、鰭和尾鰭上長(zhǎng)有單個(gè)或聚集的菜花樣腫瘤樣結(jié)節(jié)[2]。有研究[3-4]證實(shí)：在魚(yú)類心臟、脾臟等內(nèi)臟器官和眼睛中也存在病毒感染；囊腫除發(fā)生在魚(yú)體表外，在鰓、咽喉、腸壁、腸系膜、肝、脾、卵巢等器官上也可能出現(xiàn)，嚴(yán)重者可密布于全身。

LCDV 是 雙 鏈DNA 病 毒， 目 前 已 獲 知LCDV-1（歐洲株）和LCDV-C（中國(guó)株）全基因組序列，但二者基因組差異很大。基因組比較顯示，兩種LCDV 基因組在大小、組織和遺傳同一性方面具有高度的多樣性。此外，根據(jù)主要衣殼蛋白基因（MCP）序列，LCDV 至少可分為9 個(gè)基因型。MCP 基因是虹彩病毒科病毒系統(tǒng)發(fā)育研究的主要靶基因[5-6]。

LCDV作為危害魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病病原，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。本研究對(duì)山東省某牙鲆魚(yú)場(chǎng)疑似LCDV 感染病例進(jìn)行了綜合診斷，對(duì)病毒MCP 基因進(jìn)行了測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，以期為該病的綜合診斷及流行病學(xué)調(diào)查以及病原的相關(guān)分子生物學(xué)研究和疫苗制備等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2019 年1 月，山東省某牙鲆魚(yú)場(chǎng)出現(xiàn)疑似LCD 病例?；疾◆~(yú)體表出現(xiàn)菜花樣瘤狀物，死亡率超過(guò)30%。剖檢病死魚(yú)，并采集魚(yú)體表的瘤狀物及其脾臟、腎臟、腸等病料樣品各兩份。一份用10%的福爾馬林溶液固定，經(jīng)常規(guī)制作，石蠟切片、HE 染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查；另一份冰凍保存，進(jìn)行病毒DNA 提取與鑒定。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒：購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、pEASY-T1 simple cloning vector 及T1 感 受態(tài)細(xì)胞：購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker：購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中登錄的LCDV-1（L63545）、LCDV-C（AY380826）MCP 序列，分別設(shè)計(jì)2 對(duì)引物[7]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 病毒核酸提取與擴(kuò)增

參照EasyPure Viral DNA/RNA Kit 說(shuō)明書(shū)，對(duì)收集的病料研磨液進(jìn)行核酸提取。以提取的核酸為模板，用兩對(duì)LCDV 引物分別對(duì)模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 病毒MCP 基因序列測(cè)定分析

將上述核酸提取物，用LCDV LCC 引物進(jìn)行50 μL 體系擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將目的條帶所在的凝膠部分分離，使用膠回收試劑盒，回收目的片段；將膠回收的目的片段連接pEASY-T1 simple cloning 載體，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行增菌培養(yǎng)。先用PCR 對(duì)菌液進(jìn)行鑒定，將鑒定為L(zhǎng)CDV-MCP 的陽(yáng)性菌液送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行遺傳進(jìn)化特點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 眼觀病變

經(jīng)外觀及剖檢病變觀察，發(fā)現(xiàn)病變主要表現(xiàn)為魚(yú)體表長(zhǎng)有灰白色、菜花樣瘤狀物，魚(yú)鰓及魚(yú)鰭上也有多個(gè)瘤狀物（圖1），而內(nèi)臟器官未見(jiàn)明顯的眼觀病變。

圖1 病魚(yú)剖檢病變

表2 參考毒株信息

2.2 病理組織學(xué)變化

魚(yú)體表腫瘤樣組織中，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞增生、變圓、膨大和聚集，形成淋巴囊腫細(xì)胞，在胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量的包涵體（圖2-A），肝細(xì)胞普遍發(fā)生空泡變性（圖2-B），脾臟充血、出血（圖2-C），鰓小片上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落（圖2-D），腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)出血（圖2-E），腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落（圖2-F）。

圖2 感染魚(yú)的組織病理變化（HE，200×）

2.3 病毒PCR 鑒定

分別用設(shè)計(jì)的兩對(duì)LCDV 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果顯示，以LCDV-C 毒株為參考序列設(shè)計(jì)的LCC引物擴(kuò)增為陽(yáng)性，說(shuō)明該病例存在LCDV感染。

圖3 MCP 基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠圖

2.4 核苷酸和氨基酸序列分析

利用DNAstar 中的MegAlign，將本試驗(yàn)所得毒株（190103LCDVSD）和參考毒株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行同源性比較分析。通過(guò)分析可知，本試驗(yàn)所得毒株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列與參考毒株序列相比，與基因I 型LCDV-1 毒株的同源性最低，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為78.7%和86.8%；而與以LCDV-C 毒株為代表的基因II 型序列同源性較高，核苷酸和氨基酸序列同源性分別介于99.6%～99.9%和99.3%～100%。具體比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

2.5 MCP 基因遺傳演化分析

選取35 株不同基因型LCDV 的MCP 基因參考序列與本次序列，利用MEGA6 的Maximum-Likelihood 方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示：根據(jù)MCP 基因分型，本試驗(yàn)所得毒株序列與LCDV-C、JF00Kuma、JF03Yoshi、JF03GunNeA、JF、LCDV-K1 等同屬于基因II 型，且與我國(guó)牙鲆分離株LCDV-C 有較高的同源性，說(shuō)明本試驗(yàn)所得毒株在牙鲆魚(yú)中未發(fā)生較大變異。

表3 本試驗(yàn)毒株MCP 基因與不同基因型參考毒株同源性比對(duì)結(jié)果

表4 本試驗(yàn)毒株MCP 基因與基因II 型參考毒株同源性比對(duì)結(jié)果

3 討論

我國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類一般都對(duì)LCDV 易感，包括真鯛、大菱鲆、花鱸和牙鲆等[8]。LCD一年四季均可發(fā)病，其中水溫在10～20 ℃時(shí)發(fā)病達(dá)到高峰[9]。研究發(fā)現(xiàn)，該病具有自愈現(xiàn)象，且受溫度影響較大，當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，病魚(yú)體表瘤狀物會(huì)自動(dòng)掉落，魚(yú)體逐漸恢復(fù)健康；但水溫低于15 ℃時(shí)，未見(jiàn)自愈現(xiàn)象[10-11]。

虹彩病毒MCP 蛋白是其病毒粒子中表達(dá)豐度最高的蛋白，占整個(gè)病毒粒子多肽的40%～45%，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP 基因的同源性差異進(jìn)行虹彩病毒分子進(jìn)化方面的研究[12-13]。

圖4 新分離株與參考毒株的遺傳進(jìn)化樹(shù)

4 結(jié)論

病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，該病例病變符合LCD 的病理學(xué)特征；分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所檢測(cè)毒株與選定的LCDV 參考毒株核苷酸和氨基酸同源性均較高；MCP 基因遺傳進(jìn)化分析表明，所檢測(cè)毒株屬于基因II 型，與我國(guó)分離株LCDV-C 同源性較高，未發(fā)生較大變異。綜合判定該病例為L(zhǎng)CDV 感染。該研究為L(zhǎng)CD 診斷及其流行病學(xué)調(diào)查提供了新資料，為下一步進(jìn)行LCDV 相關(guān)分子生物學(xué)研究以及疫苗制備等提供了理論依據(jù)。