蘇曉慧，任 娟，李 舵，馬曉艷，美熱木古麗?巴依待拉提，烏那爾汗?吉斯汗，王 文，薛 文，秦 菊，居馬別克?夏拉巴依

（新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種急性、烈性豬傳染病，發(fā)病率、致死率可高達100%，危害嚴重，對養(yǎng)豬業(yè)可造成毀滅性打擊，可引起巨大的經(jīng)濟損失和社會影響[1]。ASF自2018 年8 月在遼寧省首發(fā)以來，已在我國多個省份發(fā)生[2-3]。為進一步加強ASF 防控，新疆地區(qū)加強臨床監(jiān)視、現(xiàn)場排查，對生豬從生產(chǎn)到屠宰全程進行采樣監(jiān)測，嚴格控制生豬及其產(chǎn)品調運監(jiān)管，多部門協(xié)調聯(lián)動，形成了良好的工作機制。

2018 年12 月5 日，新疆巴州若羌縣動物公路檢查站在攔截的袋裝水餃中采集樣品13 個批次，經(jīng)新疆動物衛(wèi)生監(jiān)督所實驗室檢測，發(fā)現(xiàn)5 個批次呈ASFV 核酸陽性。隨后，將疑似陽性樣品送中國動物衛(wèi)生流行病學中心復核，確診為ASFV 核酸陽性。為進一步了解新疆地區(qū)外地輸入豬肉水餃的ASFV 污染情況，在該區(qū)其他公路檢查站和冷庫超市開展了ASFV 排查工作，又連續(xù)排查出4 個批次的外地輸入速凍水餃為ASFV 核酸陽性。這是新疆地區(qū)自2018 年9 月開展ASF 專項排查以來，首次排查出輸入性豬肉制品攜帶ASFV。

1 材料

1.1 樣品

樣品來源：動物公路檢查站攔截的速凍豬肉餡水餃，其中來源于A 廠13 個批次、B 廠1 個批次；在冷庫、超市中抽檢B 廠速凍豬肉餡水餃11 個批次。樣品的采集、保存和運輸嚴格按照《非洲豬瘟監(jiān)測樣品采集、保存與運輸方法》[4]中的要求，以豬肉產(chǎn)品的批次為采樣單位，每批次按豬肉產(chǎn)品包裝的規(guī)格（件/箱）隨機抽樣。數(shù)量為每批次隨機抽取10 件（箱），每件（箱）采集樣品2 份，合計每批次采集樣品20 份。

1.2 試劑

天根磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（批號S7327）、DNA 病毒反應液（批號20181129）：購自北京世紀元亨動物防疫技術公司；TaqMan 探針、ASFV 特異性引物、提取陽性對照、反應陽性對照：均由中國動物衛(wèi)生流行病學中心提供。

1.3 儀器設備

上海博訊電熱恒溫水槽SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量組織研磨儀、Sigma3K-15臺式冷凍高速離心機、天隆NP968 自動核酸提取儀、QuantStudio5 實時熒光定量PCR 儀。

2 方法

2.1 樣品處理

每批次每袋隨機挑取2～3 個餃子，挑出其中的豬肉進行剪碎。在加有陶珠的組織研磨管中，加入1 mL PBS 緩沖液，再加入剪碎的樣品約100 mg，使用 Bertin Precellys 組織研磨儀進行勻漿處理。處理后放入60 ℃水浴鍋滅活30 min，每間隔5 min 顛倒混勻樣品1 次。

2.2 病毒DNA 提取

對滅活后的樣品4 ℃ 2 000 r/min，離心10 min；取200 μL 上清液，使用磁珠法病毒DNA 提取試劑盒提取DNA；將提取的核酸于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 熒光定量PCR

采用ASFV 特異熒光定量PCR 方法擴增ASFV VP72 基因片段[4]。PCR 以20 μL 體系進行：DNA 病毒熒光反應液10 μL、ROX 0.2 μL、無菌無核酸水5.7 μL、正向引物0.8 μL、反向引物0.8 μL、TaqMan 探針0.5 μL，模板DNA 2 μL。同時，設立提取陽性/陰性對照、反應陽性/陰性對照。密封反應試管，瞬時離心，放入熒光PCR 儀，按照熒光PCR 循環(huán)條件擴增。

3 結果

根據(jù)ASFV 檢測操作規(guī)程分析，樣品Ct 值低于40 為陽性。12 月5 日檢測的13 個批次樣品中，有5 個批次檢測到ASFV 特異性擴增曲線，Ct 值為28.3～32.68（圖1），其他批次熒光定量PCR 檢測結果見表2。

圖1 12 月5 日熒光PCR 擴增結果

表2 豬肉餡水餃的熒光定量PCR 檢測結果

4 討論

4.1 陽性豬肉產(chǎn)品的處置

新疆畜牧獸醫(yī)局接到中國動物衛(wèi)生流行病學中心的復核確診后立即行動，要求動物衛(wèi)生監(jiān)督部門會同食品藥品監(jiān)管部門按照應急預案開展處置工作，銷毀陽性樣品，并通知各級食品藥品監(jiān)管部門、畜牧獸醫(yī)等部門，對同批次產(chǎn)品進行無害化處理，對相關場所進行徹底清洗消毒，同時繼續(xù)加強開展ASF 疫情排查工作。

4.2 加強流調溯源

本次速凍豬肉水餃中ASFV 核酸的確診在國內是首次，能從豬肉產(chǎn)品中檢出ASFV，說明ASFV 已形成了一定污染面。此次在速凍豬肉水餃中檢出ASFV 核酸，推斷是由于潛伏期帶毒豬沒有臨床癥狀，屠宰后進入加工企業(yè)，被加工生產(chǎn)成豬肉制品所造成的[5]。ASFV 自身較脆弱，對熱抵抗力不強[6]。雖然此類豬肉制品一般直接進入餐桌，在蒸煮烹飪過程，均能將病毒殺死，但是水餃中豬肉的溯源應引起主管部門的高度重視，這也是控制疫病傳播風險的重要環(huán)節(jié)。水餃在烹飪過程中，如果未對豬肉進行高溫處理，未煮熟的水餃會以餐廚垃圾喂豬或進入養(yǎng)殖戶，很容易造成ASFV 的傳播擴散[7]。其次如果在加工處理車間，人員、車輛、污水、廢棄物處理不當，就有可能造成病毒擴散，從而引發(fā)新的疫情[7]。因此，要加強產(chǎn)地檢疫和屠宰場的實驗室檢測，及時發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬和處于潛伏期的豬，防止問題豬肉流入食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

4.3 繼續(xù)做好ASF 防控

目前國內ASF 疫情仍呈點狀散發(fā)態(tài)勢，因豬肉制品調入而傳播ASF 的風險較高，因此應該警惕通過污染病毒的豬肉制品而引發(fā)疫情的可能。鑒于目前ASF 防控形勢仍較嚴峻，今后仍需重點排查養(yǎng)殖場、生豬交易市場、屠宰場等高風險場點，同時加大公路檢查站對跨省入疆生豬和豬肉產(chǎn)品的檢查和查處力度，嚴格控制從疫區(qū)調入生豬及相關產(chǎn)品。