曾偉主，雷慶子，周景文*

(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是一種重要的短鏈二元羧酸，在動(dòng)物、微生物以及人體代謝過(guò)程中都具有重大的生理作用，是三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝和蛋白質(zhì)代謝中的一個(gè)非常重要的中間代謝產(chǎn)物[1]。此外，α-KG還參與了氮的吸收、代謝和貯藏，不僅充當(dāng)一些氨基酸的前體來(lái)源，還是谷氨酸和谷氨酰胺的氮轉(zhuǎn)運(yùn)體[2]，起到連接碳代謝和氮代謝兩大代謝的橋梁作用。除了在細(xì)胞代謝方面的重要性，α-KG在化學(xué)合成、醫(yī)藥臨床、化妝護(hù)理、食品保健、動(dòng)物飼料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，例如臨床上α-KG被用于減少尿毒癥，刺激傷口愈合，控制血脂水平，治療慢性腎功能不全血液透析患者[3]；食品方面，α-KG可用作香腸的添加劑，提高食品的風(fēng)味，作為飲食補(bǔ)充耐力[4]。α-KG的合成方法主要為化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法三類。目前化學(xué)合成法雖然是工業(yè)化生產(chǎn)α-KG的主力，但也存在許多方面的不足，比如使用過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生危險(xiǎn)化學(xué)物質(zhì)(氰化物)和有毒廢液、需要使用含銅催化劑、嚴(yán)重腐蝕設(shè)備、甘氨酸及其他有機(jī)酸等副產(chǎn)物的積累[2,5-6]。酶轉(zhuǎn)化法具有環(huán)保以及高底物轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點(diǎn)，但是生產(chǎn)成本比較高，因此通過(guò)酶轉(zhuǎn)化法來(lái)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)α-KG存在著巨大的阻力[7-9]。Yarrowialipolytica被認(rèn)定為是一種非致病性的酵母[10]，具有過(guò)量積累α-KG并能將其分泌到細(xì)胞外的能力，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[11]。近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者在利用微生物發(fā)酵法積累α-KG方面做了許多的研究工作[12-16]，發(fā)酵機(jī)理越來(lái)越明晰，碳源經(jīng)過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸(Pyruvate，PYR)，PYR進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成α-KG，因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-KG是一個(gè)非常有競(jìng)爭(zhēng)力的選擇。但是目前Y.lipolytica生產(chǎn)α-KG由于存在產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，仍未大規(guī)模進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。前期在實(shí)驗(yàn)室3 L罐中發(fā)酵生產(chǎn)α-KG時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速較低時(shí)，易導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)慢，酮酸積累量低和生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速后，菌株可迅速利用底物積累較高產(chǎn)量的酮酸。本研究在50 L發(fā)酵罐中通過(guò)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的優(yōu)化提高了α-KG產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，為發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG的工業(yè)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株YarrowialipolyticaWSH-Z06 C3，為硫胺素缺陷型菌株，由本研究室誘變選育獲得[17]。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)種子培養(yǎng)基：葡萄糖20，大豆蛋白胨10，KH2PO41，MgSO4·7 H2O 0.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油100，(NH4)2SO43，KH2PO43，MgSO4·7 H2O 1.2，NaCl 0.5，乙酸鈉 6，K2HPO40.1，CaCO310，硫胺素6×10-7(過(guò)濾除菌)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 50 L發(fā)酵罐(BLBIO-50SJ，上海百侖公司)，恒溫培養(yǎng)箱(ZYZQ-VAF，上海醫(yī)療器械研究所)，高速離心機(jī)(Eppendorf 5418，德國(guó)Eppendorf 公司)，紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-2450，日本Shimadzu公司)，高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國(guó)Agilent公司)，高壓滅菌鍋(G154DWS，無(wú)錫醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①菌株活化：從-80 ℃保存的甘油管里蘸取一定量的菌，在平板上劃線培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)挑取單菌落于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，用接種環(huán)將液體活化好的菌種劃線于茄形瓶培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。②一級(jí)種子液培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取一環(huán)茄形瓶中活化好的菌株于液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h。③二級(jí)種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的一級(jí)種子液按0.25%體積分?jǐn)?shù)接種至種子罐中，其中裝液量70%，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.8 m3/(m3·min)，罐壓0.05 MPa。④發(fā)酵培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)好的種子液按接種量10%體積分?jǐn)?shù)接種于滅好菌的發(fā)酵罐中，其中罐壓設(shè)定為0.035 MPa，裝液量設(shè)定為70%，培養(yǎng)溫度設(shè)定為28 ℃，通氣量0.8 m3/(m3·min)，pH自然下降至3.0后恒定控制在(3.0±0.2)，其他條件根據(jù)優(yōu)化策略進(jìn)行調(diào)整。

1.2.2 細(xì)胞干重測(cè)定 用2 mol/L的鹽酸或水稀釋至一定濃度后在波長(zhǎng)570 nm處用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，即OD570。細(xì)胞干重(DCW)換算公式：OD570∶DCW (g/L)= 1∶0.223[18]。

1.2.3 高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定 α-KG、甘油及PYR α-KG、甘油以及PYR均可以通過(guò)HPLC進(jìn)行測(cè)定。液相色譜條件：流動(dòng)相，5 mmol/L稀硫酸；流速：0.6 mL/min；色譜柱柱溫：40 ℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：210 nm；示差折光檢測(cè)器溫度：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[24]。色譜柱型號(hào)及規(guī)格為Aminex HPX-87H 300 mm×7.8 mm。其中，示差折光檢測(cè)器用于檢測(cè)甘油(Glycerol)；紫外檢測(cè)器用于檢測(cè)α-KG和PYR。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)速對(duì)Y.lipolytica積累α-KG的影響

基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，在50 L發(fā)酵中比較了200 r/min和300 r/min對(duì)α-KG積累的影響。設(shè)置裝液量為35 L，碳酸鈣質(zhì)量濃度為10 g/L，通風(fēng)比0.8 m3/(m3·min)，罐壓0.035 MPa，pH自然下降到3后恒定控制在(3.0±0.2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

當(dāng)控制轉(zhuǎn)速為200 r/min 時(shí)(圖1A)，在前36 h內(nèi)，菌株快速生長(zhǎng)，有機(jī)酸迅速積累，其中PYR的積累速度大于α-KG；在48 h時(shí)pH降至3.0，PYR達(dá)到最高值7.5 g/L。當(dāng)通風(fēng)比降低一半后PYR的量逐漸降低，并維持在3 g/L左右；32 h后，α-KG以5 g/(L·h)的速度增加，發(fā)酵144 h，α-KG產(chǎn)量為39.62 g/L，PYR為3.08 g/L，甘油剩余5.54 g/L。當(dāng)控制轉(zhuǎn)速為300 r/min 時(shí)(圖1B)，PYR積累速度大為提高，在24 h時(shí)pH降至3.0；發(fā)酵144 h，α-KG的最終產(chǎn)量為32.4 g/L，PYR為19.66 g/L。提高轉(zhuǎn)速使得α-KG的產(chǎn)量有所降低，但PYR和α-KG的總產(chǎn)量卻明顯提高，為增加α-KG的積累只需進(jìn)一步調(diào)控PYR轉(zhuǎn)化為α-KG。轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)甘油的消耗速度低于300 r/min時(shí)甘油的消耗速度，不利于后期補(bǔ)料。繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速可能不利于α-KG的積累，因此，選取轉(zhuǎn)速300 r/min進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 50 L發(fā)酵罐中不同轉(zhuǎn)速對(duì)α-KG積累的影響Fig.1 Effect of different rotate speeds on accumulating α-KG in 50 L fermentorA：CaCO3 10 g/L，200 r/min；B：CaCO3 10 g/L，300 r/min

2.2 碳酸鈣濃度對(duì)Y.lipolytica積累Yα-KG的影響

添加碳酸鈣作為一種常見(jiàn)的pH調(diào)控手段，能夠影響微生物的外在酸堿環(huán)境，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)。碳酸鈣中的Ca2+能夠提高PYR羧化酶的活性，CO32-則有可能作為PYR羧化反應(yīng)的底物[19]，從而促進(jìn)PYR進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步代謝生成α-KG。由于之前添加的碳酸鈣質(zhì)量濃度只有10 g/L，不足以緩沖發(fā)酵液酸化。發(fā)酵液pH過(guò)早迅速降低，可能會(huì)對(duì)Y.lipolytica的生長(zhǎng)造成不利影響，從而影響α-KG的積累。因此，進(jìn)一步考察了提高碳酸鈣質(zhì)量濃度到20 g/L對(duì)α-KG積累的影響。設(shè)置轉(zhuǎn)速300 r/min，通風(fēng)比0.8 m3/(m3·min)，罐壓0.035 MPa，pH自然下降至3.0后恒定控制在(3.0±0.2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

對(duì)比10 g/L和20 g/L碳酸鈣濃度(分別如圖1B和圖2)的發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同碳酸鈣濃度時(shí)酮酸積累的趨勢(shì)存在顯著差異。碳酸鈣質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，前期α-KG積累速度明顯加快，PYR在60 h達(dá)到最大值后開(kāi)始降低，α-KG在108 h時(shí)達(dá)到最高值38.55 g/L。與碳酸鈣質(zhì)量濃度為10 g/L條件相比，pH降低到3.0的時(shí)間延遲了24 h，但是達(dá)到最高值的時(shí)間卻提前了32 h。推測(cè)過(guò)早的pH降低可能會(huì)影響菌體的活性。因此，綜合產(chǎn)量和生產(chǎn)效率兩方面考慮，碳酸鈣添加量為20 g/L更有利于后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 50 L發(fā)酵罐中20 g/L碳酸鈣質(zhì)量濃度對(duì)α-KG積累的影響Fig.2 Effect 20 g/L CaCO3 on accumulating α-KG in 50 L fermentor

2.3 溶氧對(duì)Y.lipolytica積累α-KG的影響

Y.lipolytica是一種二態(tài)性酵母，為單細(xì)胞狀態(tài)或者菌絲狀態(tài)。溶氧、pH、氮源等因素是影響其二態(tài)性轉(zhuǎn)換的重要因素[20-21]。實(shí)驗(yàn)所用的Y.lipolyticaWSH-Z06 C3是一種好氧菌株。氧是影響微生物生理代謝的一個(gè)重要因素，溶氧可能會(huì)在很大程度上影響細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、代謝反應(yīng)、底物消耗與產(chǎn)物積累。在碳酸鈣20 g/L，300 r/min條件下發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中溶氧反彈后穩(wěn)定在70%左右，此條件下PYR的積累量仍然比較高，可能溶氧較高影響了PYR進(jìn)入三羧酸循環(huán)。因此，對(duì)50 L罐中的溶氧水平進(jìn)行分析，將溶氧反彈后分別控制在60%和50%，考察溶氧對(duì)α-KG積累的影響。結(jié)果如圖3所示。

對(duì)比圖2和圖3發(fā)現(xiàn)，在溶氧為70%左右時(shí)，甘油96 h才消耗完全，溶氧水平控制在60%和50%時(shí)(圖3A和3B)，甘油在72 h時(shí)消耗完全，比控制在70%時(shí)提前了24 h。溶氧控制在60%時(shí)，PYR最高積累量為27.32 g/L，略高于溶氧控制在70%和50%。當(dāng)甘油消耗完全后，菌體消耗PYR的速度與控制溶氧水平呈負(fù)相關(guān)，控制溶氧在50%時(shí)α-KG生成速度明顯比60%和70%時(shí)快，在96 h時(shí)α-KG達(dá)到最大值42.39 g/L。

圖3 50 L發(fā)酵罐中溶氧對(duì)α-KG積累的影響Fig.3 Effect of different dissolved oxygen on accumulating α-KG in 50 L fermentorA：溶氧 (60%±2%)；B：溶氧 (50%±2%) A：dissolved oxygen (60%±2%)；B：dissolved oxygen (50%±2%)

2.4 補(bǔ)料方式對(duì)Y.lipolytica積累α-KG的影響

前期甘油質(zhì)量濃度均為100 g/L。如果在同樣的發(fā)酵周期內(nèi)能夠更多地消耗底物，使得α-KG的積累量能夠最大限度地提高，顯然能夠提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。因此，考察了以下三種控制方式對(duì)α-KG積累的影響，保持三者的甘油總量一致，分別為初始甘油質(zhì)量濃度為150 g/L；以初始甘油質(zhì)量濃度100 g/L為基礎(chǔ)，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度降至20 g/L左右時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，即在60、72、84、96和108 h共進(jìn)行5次補(bǔ)料，每次補(bǔ)入10 g/L(350 g)，共1 750 g；以初始甘油質(zhì)量濃度100 g/L為基礎(chǔ)，在60 ～100 h內(nèi)通過(guò)恒速將甘油質(zhì)量濃度補(bǔ)加至150 g/L，流速為43.75 g/L，共補(bǔ)入1 750 g。其他發(fā)酵條件為碳酸鈣20 g/L，轉(zhuǎn)速300 r/min，通風(fēng)比0.8 m3/(m3·min)，罐壓0.035 MPa，pH自然下降至3.0后恒定控制在(3.0±0.2)，溶氧反彈后控制在50%。結(jié)果如圖4所示。

圖4 50 L發(fā)酵罐中初始高濃度甘油和不同補(bǔ)料模式對(duì)α-KG積累的影響Fig.4 Effect of high initial glycerol concentration and different feeding fermentation on accumulating α-KG in 50 L fermentorA：甘油150 g/L；B：多節(jié)點(diǎn)補(bǔ)料；C：恒速補(bǔ)料A:150 g/L glycerol;B:Intermittently feeding;C:Constant feeding

初始甘油質(zhì)量濃度為150 g/L時(shí)甘油消耗完全的時(shí)間略短于兩種補(bǔ)料方式，但前期消耗速度明顯比補(bǔ)料方式慢，因?yàn)楦邼舛鹊母视蛯?duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。在60 h之前，初始甘油質(zhì)量濃度150 g/L時(shí)的PYR迅速積累明顯高于補(bǔ)料方式下的PYR積累速度，而α-KG的積累量三者差異不顯著。初始甘油質(zhì)量濃度為150 g/L和多節(jié)點(diǎn)補(bǔ)料條件下的PYR在60 h后均能保持快速積累，積累量最高分別可達(dá)到42.39 g/L 和43.93 g/L，α-KG與PYR呈相似趨勢(shì)，而恒速補(bǔ)料條件下的PYR積累量基本維持在20 g/L，α-KG一直呈快速積累趨勢(shì)，至144 h甘油消耗完全時(shí)，α-KG的積累量達(dá)到66.27 g/L。應(yīng)用恒速補(bǔ)料策略的α-KG的轉(zhuǎn)化率(44.18%)明顯高于高濃度初始甘油發(fā)酵策略(30.29%)和多節(jié)點(diǎn)補(bǔ)料策略(35.30%)。采用恒速補(bǔ)料方式可實(shí)現(xiàn)高生產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的相對(duì)統(tǒng)一。

3 討 論

前期研究人員在3 L發(fā)酵罐中通過(guò)pH調(diào)控控制菌體質(zhì)量濃度在12 g/L 和10 g/L時(shí)α-KG產(chǎn)量最高分別為49.4 g/L和54.0 g/L[22]，本文研究了在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化對(duì)提高解脂亞洛酵母積累α-KG的影響。比較不同轉(zhuǎn)速(200、300 r/min)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)更有利于α-KG的積累，這也與之前在3 L發(fā)酵罐中的研究結(jié)果相符，可能是由于300 r/min時(shí)發(fā)酵液中的前期溶氧較高，由于本研究使用的菌株是好氧型，對(duì)氧的要求較高，因此前期較高的溶氧可能更有利于菌體長(zhǎng)得又快又好。由于α-KG和PYR的積累會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中的pH快速下降，影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累，適當(dāng)增加碳酸鈣濃度有利于緩沖發(fā)酵液中的pH，而且碳酸鈣中的鈣離子有利于PYR羧化酶活性的提高，碳酸根離子作為底物參與PYR的羧化反應(yīng)[23]，從而有利于α-KG的積累。通過(guò)比較后期溶氧水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶氧在相對(duì)較低(50%)時(shí)不但能促進(jìn)α-KG的積累，而且還可以縮短發(fā)酵周期，說(shuō)明在發(fā)酵后期微好氧條件可能更有利于α-KG的積累。最后，在上述優(yōu)化的條件下通過(guò)恒速補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵144 h 后α-KG的積累量達(dá)66.27 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為44.18%，相對(duì)于初始過(guò)程分別提高了67.3%和4.56%。上述發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化提高了α-KG的產(chǎn)量和產(chǎn)率，并且縮減了發(fā)酵周期，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)α-KG工業(yè)化提供了參考。今后的工作還可通過(guò)分析發(fā)酵過(guò)程中甘油的比消耗速率、產(chǎn)物α-KG和副產(chǎn)物PTR的比生成速率與菌體生長(zhǎng)之間的關(guān)系，并結(jié)合氮源、硫胺素等重要物質(zhì)的流加策略，來(lái)進(jìn)一步提高解脂亞洛酵母積累α-KG。