朱俊龍，凌慶慧，劉 茜，徐 林

(華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 上海市綠色化學(xué)與化工過程綠色化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200062)

肼是生產(chǎn)農(nóng)藥、醫(yī)藥、聚合物、乳化劑和紡織染料等精細(xì)化學(xué)品的重要組分[1]。肼具有高可燃性和高燃燒焓，常用作導(dǎo)彈和衛(wèi)星推進(jìn)系統(tǒng)中的高能燃料,被稱為“火箭燃料”。它還在某些類型的燃料電池中作為反應(yīng)物起著關(guān)鍵作用。然而，這種廣泛使用的化學(xué)物質(zhì)具有致癌性和毒性[2]，容易被吸入和攝入而引起急性中毒，接觸到皮膚會(huì)致癌和誘發(fā)突變，急性接觸會(huì)對(duì)肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，而長(zhǎng)期接觸會(huì)對(duì)脾臟、甲狀腺和呼吸道造成嚴(yán)重傷害，還可能導(dǎo)致暫時(shí)性失明以及對(duì)DNA產(chǎn)生不利影響[3]。因此，美國(guó)環(huán)保署已將肼列為B2類化學(xué)品，規(guī)定允許的上限為10×10-9[4]。

迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)展了各種用于定性檢測(cè)和定量測(cè)定肼的技術(shù)，包括色譜技術(shù)[5](如高效液相色譜[6]、氣相色譜[7]和離子色譜[8])、色譜耦合質(zhì)譜[9]、電化學(xué)方法[10](如毛細(xì)管電泳法[11]、電量分析法[12]、電位法[13]、電流分析法[14]、離子選擇性電極法[15])以及滴定法[2]。這些方法大多數(shù)需要進(jìn)行樣品制備，處理時(shí)間較長(zhǎng)并且設(shè)備昂貴復(fù)雜，因此現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)肼非常困難。此外，由于這些方法是侵入性的，也難以實(shí)現(xiàn)對(duì)肼的體內(nèi)監(jiān)測(cè)和成像[16]。

小分子熒光探針具有成本低、易于合成、靈敏度高、特異性好、能夠?qū)崟r(shí)分析等特點(diǎn)而倍受關(guān)注[17-20]。因此，設(shè)計(jì)高選擇性和高靈敏度的小分子熒光探針來檢測(cè)痕量肼，受到越來越多人的關(guān)注[21]。迄今為止，N2H4熒光探針主要是基于肼的強(qiáng)親核性，與修飾在熒光團(tuán)上的識(shí)別基團(tuán)反應(yīng)。這些識(shí)別基團(tuán)，在調(diào)節(jié)電子過程中起著重要作用，包括激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited—state intramolecular proton transfer，ESIPT)，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)或分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer，ICT)[22-23]。雖然已有很多N2H4熒光探針相關(guān)文獻(xiàn)[24-32]，但相關(guān)綜述卻鮮有報(bào)道?？紤]到過去幾年用于檢測(cè)肼的小分子熒光探針研究取得了重要進(jìn)展，因此，本文對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)和綜述。為了更好的理解，本文從熒光探針的檢測(cè)機(jī)理方面進(jìn)行分類闡述。

1 基于熒光團(tuán)脫保護(hù)機(jī)理檢測(cè)肼的小分子熒光探針

肼具有很強(qiáng)的親核性，因此可以用于脫除熒光團(tuán)上的識(shí)別基團(tuán)，包括乙酰丙酰基[24]、4-溴丁酰基[25-27]、鄰苯二甲酰亞胺基[28-29 ]以及乙酰基[ 30]等。

1.1 乙酰丙?；鳛樽R(shí)別基團(tuán)的小分子熒光探針

乙酰丙?；怯袡C(jī)合成中常用的保護(hù)基團(tuán)，能選擇性地與肼反應(yīng)。基于此，Choi等[24]設(shè)計(jì)合成了修飾有乙酰丙?；南愣顾匮苌?作為N2H4熒光探針。在含30%水、pH 4.5的DMSO溶液中，探針1在307和336 nm處有強(qiáng)度適中的紫外吸收峰以及在458 nm處有很弱的熒光發(fā)射峰。當(dāng)加入肼后，在426 nm處有顯著的吸收峰生成，同時(shí)，458 nm處的熒光發(fā)射增強(qiáng)了250倍，如圖1所示。這是由于肼選擇性脫去乙酰丙酰基后，生成的3-氰基-7-羥基香豆素具有特征性的黃綠色以及藍(lán)色熒光，如圖2所示。而當(dāng)分別加入其它金屬陽離子、陰離子時(shí)，吸收和發(fā)射譜基本沒有變化，表明了探針1對(duì)肼的高選擇性識(shí)別(見圖1)。這一探針作為方便的信號(hào)傳導(dǎo)工具，實(shí)現(xiàn)了在水環(huán)境中光學(xué)測(cè)定肼。

圖1 肼(1.0×10-3mol·L-1)、金屬離子(1.0×10-3mol·L-1)、陰離子(1.0×10-3mol·L-1)分別存在下，探針1(1.0×10-5mol·L-1)在醋酸緩沖液(pH=4.5，10 mmol·L-1)和DMSO的混合液中(3∶7，v/v)的吸收光譜(a)和發(fā)射光譜(b)(混合15 min后測(cè)試)Fig.1 UV-vis spectra (a)and fluorescence spectra (b)of probe 1 in the presence of hydrazine,representative metal ions,and anions.[1] = 1.0×10-5mol·L-1,[hydrazine] = [Mn+] = [An-]=1.0×10-3mol·L-1in a mixture of acetate buffer (pH=4.5,10 mmol·L-1)and DMSO (3∶7,v/v).Measured after 15 min of mixing

圖2 乙酰丙?；牧u基香豆素1對(duì)肼的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.2 Signaling of hydrazine by levulinated hydroxycoumarin 1

1.2 4-溴丁?；鳛樽R(shí)別基團(tuán)的小分子熒光探針

4-溴丁?；c肼反應(yīng)的機(jī)理與乙酰丙?；愃?，因此也可以用作肼的識(shí)別基團(tuán)?；诖耍珿oswami等[25]構(gòu)筑了基于2-(2′-羥基苯)苯并噻唑(HBT)的比率型N2H4熒光探針2，利用4-溴丁?；〈鶫BT的羥基氫，進(jìn)而抑制HBT的ESIPT。當(dāng)探針2接觸肼后，經(jīng)過SN2取代、環(huán)化、消除，得到脫保護(hù)的HBT，ESIPT得到恢復(fù)，如圖3所示。隨著肼的逐漸加入，探針2在285 nm處的吸收峰和368 nm處的發(fā)射峰降低，在343和458 nm處分別生成新的吸收峰和發(fā)射峰，但加入陰離子、金屬離子和其它有機(jī)堿，探針2的吸收光譜和發(fā)射光譜基本沒變化，如圖4所示。此外，活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)證明了探針2能夠追蹤細(xì)胞內(nèi)痕量的肼。因此，該探針2可用于檢測(cè)天然樣品中產(chǎn)生肼的菌株，還可精確測(cè)定樣品中肼的濃度。

基于同樣的策略，Qian等[26]報(bào)道了一例新穎的比色型和紅色熒光的探針3，如圖5所示。這一“開啟”型熒光探針在水溶液中加入肼后，最大吸收峰紅移了117 nm，最大發(fā)射峰增強(qiáng)了約16倍，顯示出良好的選擇性和低的檢測(cè)限，成功地檢測(cè)到了活細(xì)胞中的肼，有望進(jìn)一步用于檢測(cè)組織和動(dòng)物體內(nèi)的肼。

同樣利用4-溴丁?；c肼的反應(yīng)，Lu等[27]發(fā)展了具有雙發(fā)射的比色熒光探針4，如圖6所示。該探針在肼的存在下，627 nm處的熒光顯著增強(qiáng)，而814 nm處的近紅外熒光顯著減弱，同時(shí)日光下顏色從藍(lán)綠色轉(zhuǎn)變成紅色，如圖7所示。利用雙發(fā)射波長(zhǎng)的顯著變化，可以檢測(cè)到最低0.38×10-9濃度的肼。相比于其他比率型近紅外探針，該探針能在生理環(huán)境的pH下，在含有少量有機(jī)溶劑的水溶液中識(shí)別肼，同時(shí)也成功應(yīng)用于在海拉細(xì)胞以及活鼠體內(nèi)檢測(cè)肼。

圖3 探針2識(shí)別肼的機(jī)理Fig.3 Mechanism of the response of probe 2 to hydrazine

圖4 隨著肼(0～20 μmol·L-1)逐漸增加，探針2 (10 μmol·L-1)的紫外可見吸收光譜(a)和發(fā)射光譜(b)的變化(混合60 s后記錄光譜)；(c)在肼和其他代表性的陽離子、陰離子、有機(jī)堿(20 μmol·L-1)存在下，探針2 (10 μmol·L-1)的熒光光譜(λex= 300 nm)Fig.4 Change of UV-vis spectra (a)and emission spectra (b)of probe 2 (10 μmol·L-1)with incremental addition of hydrazine (0～20 μmol·L-1),spectra were recorded after 60 s of each mixing,(c)fluorescence spectra of probe 2 (10 μmol·L-1)in the presence of hydrazine and other representative cations,anions,and organic bases (20 μmol·L-1each).λex= 300 nm

圖5 探針3識(shí)別肼的機(jī)理Fig.5 Mechanism of the response of probe 3 to hydrazine

圖6 探針4識(shí)別肼的機(jī)理Fig.6 Mechanism of the response of probe 4 to hydrazine

圖7 在DMSO-H2O中(1∶4,v/v,PBS 20 mmol·L-1,pH=7.4;λem/ex= 627/580 nm,λem/ex=814/780 nm)，有肼(200 μmol·L-1)和無肼條件下，探針4 (10 μmol·L-1)的吸收光譜變化(a)和熒光光譜變化(b)，插圖顯示了在自然光下有肼和無肼條件下探針的顏色變化Fig.7 Absorption spectral changes (a)and fluorescence spectral changes (b)of probe 4 (10 μmol·L-1)in the absence and presence of hydrazine (200 μmol·L-1)in DMSO-H2O (1∶4,v/v,PBS 20 mmol·L-1,pH=7.4;λem/ex= 627/580 nm and λem/ex= 814/780 nm),inset showed the color change of probe with or without hydrazine in natural light

1.3 鄰苯二甲酰亞胺基作為識(shí)別基團(tuán)的小分子熒光探針

Cui等[28]設(shè)計(jì)合成了一例鄰苯二甲酰亞胺修飾的甲基香豆素5，如圖8所示。利用Gabriel肼解生成7-氨基-4-甲基香豆素和魯米諾，實(shí)現(xiàn)了顏色從黃色到無色，熒光從480到420 nm，以及H2O2活化引發(fā)的化學(xué)發(fā)光，如圖9所示。此外，這一獨(dú)特的比色型、比率型以及化學(xué)發(fā)光型三重光信號(hào)探針無論在氣態(tài)還是水溶液中都能精確檢測(cè)肼。

基于Gabriel肼解的策略，Cui等[29]又將鄰苯二甲酰亞胺修飾在萘酰亞胺上，得到了一例高選擇性的N2H4熒光探針6，如圖10所示。在肼的存在下，探針6能在2 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)熒光開啟以及顏色從無色變?yōu)辄S色。溶液中肼的檢測(cè)限可達(dá)0.3×10-9，低于美國(guó)環(huán)保署規(guī)定的10×10-9的上限，同樣氣態(tài)肼的檢測(cè)限也能達(dá)到111.7 mg·m-3。此外，活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了探針6在實(shí)際應(yīng)用中的潛在價(jià)值。

圖8 探針5識(shí)別肼的機(jī)理Fig.8 Mechanism of the response of probe 5 to hydrazine

圖9 在H2O/DMSO (3∶7,v/v)的混合溶劑中加入肼后，探針5的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)的變化，(λex= 380 nm)，(c)在H2O/DMSO (3∶7,v/v)的混合溶劑中，在有肼(1.0 μmol·L-1)和無肼條下，探針5的熒光光譜；(d)探針5 (1.1 μmol·L-1,H2O/DMSO:3∶7,v/v)在420 nm處的熒光強(qiáng)度與480 nm處的熒光強(qiáng)度的比值，與肼的濃度的函數(shù)關(guān)系，室溫下，探針與不同物質(zhì)在H2O/DMSO (3∶7,v/v)混合溶劑中反應(yīng)1 min后記錄下光譜(λex= 380 nm)Fig.9 UV-vis (a)and FL emission (b)spectra changes of CF upon addition of hydrazine in H2O/DMSO (3∶7,v/v).λex=380 nm,(c)fluorescence spectra of probe CF (1.0 μmol·L-1)recorded without and with hydrazine (1.0 μmol·L-1)in an aqueous mixture (H2O/DMSO:3∶7,v/v),(d)the ratio changes of the fluorescence intensity (FI)at 420 nm verses 480 nm observed for CF (1.1 μmol·L-1in H2O/DMSO:3∶7,v/v)as a function of hydrazine concentration,each spectrum was recorded after reaction of the probe with the various species for 1 min in a mixture of H2O/DMSO (3∶7,v/v)at r.t.and obtained using excitation at 380 nm

圖10 探針6識(shí)別肼的機(jī)理Fig.10 Mechanism of the response of probe 6 to hydrazine

圖12 探針8識(shí)別肼的機(jī)理Fig.12 Mechanism of the response of probe 8 to hydrazine

1.4 乙?；鳛樽R(shí)別基團(tuán)的小分子熒光探針

Zhang等[30]基于ICT機(jī)理和肼的親核性，設(shè)計(jì)合成了一例乙?；揎椀陌牖ㄝ紵晒馓结?，用于檢測(cè)水溶液和人血清樣品中的肼，如圖11所示。在肼的存在下，探針7的吸收和發(fā)射都發(fā)生明顯改變(最大吸收從585 nm紅移至690 nm，706 nm處的發(fā)射明顯增強(qiáng))。這一“開啟”型近紅外探針在生理環(huán)境的pH下具有高選擇性和低的檢測(cè)限(5.4×10-9)，并成功用于細(xì)胞成像和活鼠組織器官成像。

2 基于成環(huán)反應(yīng)的小分子熒光探針檢測(cè)肼

除了上述基于熒光團(tuán)脫保護(hù)檢測(cè)肼的小分子熒光探針，還有部分探針利用與肼發(fā)生成環(huán)反應(yīng)來檢測(cè)肼。

Lee等[31]制備了一例三氟乙酰丙?；〈妮刘啺诽结?，其中三氟乙酰丙?；鳛殡碌淖R(shí)別基團(tuán)，在肼的誘導(dǎo)下成環(huán)得到綠色熒光化合物9，如圖12所示。該探針具有低的檢測(cè)限(3.2×10-9)和高的選擇性(即使有其他胺類存在)。將探針8覆蓋在TLC板上可以高選擇性檢測(cè)氣態(tài)肼。此外，該探針還能在其他胺類和金屬離子存在的海拉細(xì)胞中選擇性檢測(cè)肼。

Roy等[32]設(shè)計(jì)合成了分別基于芘和蒽的開啟型熒光探針10和11。如圖13所示，在肼的作用下，探針10和11與肼分別生成中間體10a′和11a′，然后在甲醇的親核進(jìn)攻下發(fā)生“Michael”加成分別得到10a和11a，熒光分別增強(qiáng)了83和173倍。如圖14所示，與其他陽離子、陰離子和小分子相比，探針10和11均對(duì)肼有很高的選擇性，同時(shí)最低檢測(cè)限分別達(dá)到了5.4×10-9和7.7×10-9。

圖13 探針10或11識(shí)別肼的機(jī)理Fig.13 Mechanism of the response of probe 10 or 11 to hydrazine

圖14 25 ℃，pH=7.4時(shí)，在混合溶液中(H2O/MeOH,4∶1,v/v含1 % DMSO作為輔助溶劑，HEPES作為緩沖溶液)，在每個(gè)探針中加入不同的陽離子，陰離子和小分子(各100 μmol·L-1)，346 nm 激發(fā)下(狹縫寬度為3/3 nm)，探針10(10 μmol·L-1)的熒光光譜(a)和在367 nm激發(fā)下 (狹縫寬度為3/3 nm)探針11 (10 μmol·L-1)的熒光光譜(b)Fig.14 Fluorescence spectra of (a)probe 10 (10 μmol·L-1)with λexat 346 nm (slit widths 3/3 nm)and (b)probe 11 (10 μmol·L-1)with λexat 367 nm (slit widths 3/3 nm)along with spectral changes after addition of various cations,anions,and small molecules (100 μmol·L-1each)to each of the probes in mixed solvent media (H2O/MeOH,4∶1,v/v with 1% DMSO as a cosolvent,buffered with HEPES)at pH=7.4 at 25 ℃

3 結(jié) 語

本文總結(jié)了近幾年來用于檢測(cè)肼的小分子熒光探針，包括基于脫熒光團(tuán)保護(hù)基和成環(huán)反應(yīng)的反應(yīng)型探針。利用熒光探針成本低、易于合成、靈敏度高、特異性好、能夠?qū)崟r(shí)分析等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了體外檢測(cè)、細(xì)胞成像、組織成像甚至活體內(nèi)成像。但是大部分探針需要與肼反應(yīng)幾min甚至幾十min，因此快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肼依然是個(gè)難題。另外體內(nèi)分析檢測(cè)肼仍處于開始階段，依然需要研究者不斷探索，特別是發(fā)展在復(fù)雜生理環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定的肼探針。