趙曉亞，王藝茸，周紅，蔡杰，張菁，向紅平，張敏，韓勇

(1.武漢海關(guān)技術(shù)中心，武漢 430021；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；4.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022)

霉酚酸(mycophenolic acid, MPA)是一種新型的抗代謝免疫抑制藥，其通過抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)阻斷DNA的從頭合成，從而抑制T和B淋巴細胞增殖發(fā)揮作用[1-2]。目前，臨床常用的MPA制劑包括嗎替麥考酚酯(MMF，商品名：驍悉)和麥考酚鈉腸溶片(商品名：米芙)，它們常與他克莫司和糖皮質(zhì)激素組成三聯(lián)免疫抑制治療方案，對預(yù)防器官移植術(shù)后急慢性排斥反應(yīng)具有重要意義。近年來，臨床研究表明，MPA藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)與其臨床療效和不良反應(yīng)發(fā)生密切相關(guān)[3-5]，但個體MPA-AUC存在較大差異，可通過治療藥物濃度監(jiān)測(TDM)進行個體化劑量調(diào)整[6-7]。國內(nèi)外已有眾多有關(guān)MPA在腎移植和肝移植患者體內(nèi)藥動學(xué)研究及TDM報道[8-10]，但筆者尚未見在心臟移植患者中報道。為此，本文旨在參照生物樣本分析方法指導(dǎo)原則[11-12]，建立液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)法檢測MPA，并將該方法學(xué)用于心臟移植患者術(shù)后MPA的藥動學(xué)研究，為臨床個體化用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器 LC-20ADXR型高效液相色譜儀(日本島津公司)，API 6500型-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)，AB135-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)，5804R 低溫高速離心機(德國 Eppendorf公司)，Milli-Q 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2試劑 霉酚酸對照品(中國食品藥品檢定研究院, 含量>99%)，霉酚酸-d3內(nèi)標(加拿大TRC公司，含量98%)，色譜級甲醇(美國Sigma公司，含量≥99.9%)，色譜級乙腈(美國Sigma公司，含量≥99.9%)，色譜級甲酸(德國CNW公司，含量≥98.0%)，色譜級乙酸銨(德國CNW公司，含量≥98.0%)。

1.3色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(2.1 mm×50 mm, 3.5 μm)；流動相：5 mmol·L-1乙酸銨(含0.25%甲酸)溶液 (A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫：0～1 min，75%A；1～8 min，75%→5%A；>8～9 min，5%A；>9～9.5 min, 5%→75%A ；>9.5～15 min，75%A。流速0.2 mL·min-1；進樣體積：2 μL；柱溫：28 ℃。

1.4質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化電離源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓：-4500 V；干燥溫度：350 ℃；離子源氣體 1 (N1)壓強：344.75 kPa；離子源氣體2 (N2)壓強：413.70 kPa；氣簾氣壓強：241.32 kPa。定量方式為多重反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；MPA的離子對、解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)分別為：m/z319.1→191.0、-100 V和-26 V；MPA-d3離子對、DP、CE分別為：m/z322.1→191.1、-60 V和-31 V。

1.5儲備液及工作液的配制 精密稱取MPA 20 mg、MPA-d3對照品1 mg分別置于10 mL棕色量瓶中，均以甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，即得2 mg·mL-1MPA儲備液,0.1 mg·mL-1MPA-d3儲備液，置于4 ℃避光保存。

1.6標準曲線血漿樣品及質(zhì)控血漿樣品的制備 精密量取儲備液，加入一定量甲醇，配制一系列含有MPA(1, 5, 10, 50, 100, 200, 400 μg·mL-1)的標準曲線工作液及含有MPA(1.25, 75, 250 μg·mL-1)的質(zhì)控工作液。取空白血漿200 μL，分別加入MPA標準曲線系列工作液和質(zhì)控對照品工作液20 μL，混勻后得到標準曲線血漿樣品(0.1，1，5，10，20，40 μg·mL-1)及質(zhì)控血漿樣品 (0.125, 7.5, 25 μg·mL-1)。

1.7樣品前處理 取血漿樣品200 μL，置于1.5 mL離心管，加入2 μg·mL-1內(nèi)標溶液20 μL，加入乙腈800 μL，渦旋混合均勻，于4 ℃ ，以12 000×g。取上清液200 μL,加入乙腈800 μL后混勻，取200 μL加入2 mL進樣瓶。

1.8藥動學(xué)研究 將本文建立的MPA檢測方法應(yīng)用于心臟移植患者MMF單次給藥后藥動學(xué)研究(分別于服藥前，服藥后0.5,1,1.5，2，4，6，8，10，12 h采血)以及維持治療達穩(wěn)態(tài)后MPA谷濃度測定。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準，采血前告知患者實驗?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺?，EDTA 抗凝管采集靜脈血 2 mL，分離血漿后，按本研究的方法進行檢測。

采用Winnonlin軟件以非房室法計算MPA藥動學(xué)參數(shù)，如清除率(CL/F)、表觀分布容積(Vd)，峰濃度(Cmax)和達峰時間(tmax)均為實測值；根據(jù)末端相3-4點血藥濃度-時間數(shù)據(jù)估算消除速率常數(shù)(Ke)，進而計算消除半衰期(t1/2)；以梯形法估算AUC0-12和AUC0-∞。

2 結(jié)果

2.1方法專屬性 在本研究測定條件下，MPA、MPA-d3的保留時間分別為 5.94和5.93 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾MPA和內(nèi)標的測定。典型色譜圖見圖1。

A.空白血漿；B.空白血漿+ MPA對照品；C.空白血漿+MPA-d3；D.心臟移植患者血漿樣本；1.MPA；2.MPA-d3。

2.2標準曲線與線性范圍 取MPA分別為 0.1, 1, 5, 10, 20, 40 μg·mL-1的標準曲線混合血漿樣品，按“1.7”項下方法進行操作，記錄色譜峰面積，以MPA與內(nèi)標的峰面積比(Y)分別對血漿中二者的濃度進行加權(quán)線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/χ2[13]，求得二者標準曲線方程如下：Y=2.416 16X+0.013 96 (r=0.999 6)，共評價4條標準曲線，R2值均>0.995。4條標準曲線相應(yīng)的校正標樣回算濃度與標示值的百分比均符合指導(dǎo)原則，表明MPA在 0.1～40 μg·mL-1線性良好。

2.3準確度與精密度 取定量下限(0.1 μg·mL-1)、低(0.125 μg·mL-1)、中(7.5 μg·mL-1)、高(25 μg·mL-1)共 4 個濃度血漿樣品，每一濃度每天平行測定5份，以計算準確度和日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，獲得日間精密度，結(jié)果見表1。

2.4提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 按照“1.7”項下方法處理低、中、高濃度質(zhì)控血樣各6份，記錄色譜峰面積為A1。另取18份空白血漿處理后獲得上清液，再加入相應(yīng)的低、中、高濃度質(zhì)控工作液，記錄色譜峰面積為A2。取相同濃度的低、中、高濃度質(zhì)控工作液直接進樣，記錄色譜峰面積為A3。提取回收率=A2/A1?；|(zhì)效應(yīng)=A3/A2。MPA低、中、高濃度質(zhì)控的提取回收率分別為96.9%，96.3%，97.9%，RSD分別為3.3%，3.1%，3.2%。MPA低、中、高濃度的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為100.4%，99.7%，106.5%，RSD分別為2.9%，2.6%，3.9%。表明血漿介質(zhì)對MPA測定無干擾。

2.5殘留 本實驗考察檢測高濃度樣品(40 μg·mL-1)后在空白血漿中的殘留，結(jié)果顯示，MPA殘留為0.07%，符合生物樣本分析的要求。

2.6穩(wěn)定性實驗 據(jù)文獻報道MPA的全血標本在室溫放置2 h[14]，以及25 ℃放置1 d穩(wěn)定[15]，因此，本研究不再重復(fù)考察MPA在全血標本中的穩(wěn)定性。本研究考察MPA低、中、高濃度血漿質(zhì)控品各3份處理后，室溫放置1 d，4 ℃避光放置 1,3,7 d的穩(wěn)定性。同時，考察低、中、高濃度質(zhì)控品4 ℃放置7 d、-20 ℃ 放置1個月和3個月的穩(wěn)定性以及-20 ℃ 凍融3次的穩(wěn)定性。結(jié)果表明前處理后的樣本4 ℃避光7 d穩(wěn)定，血漿樣本保存于-20 ℃3個月穩(wěn)定，反復(fù)凍融 3 次穩(wěn)定。

2.7MPA濃度檢測在心臟移植患者中的應(yīng)用 6例心臟移植患者按給予MMF 1 g后，血漿中霉酚酸變化的藥時曲線見圖2，藥動學(xué)參數(shù)如下：tmax為(1.83±1.13)h，Cmax為(7.58±5.09)μg·mL-1，AUC0-12為(26.58±7.23)μg·mL-1·h，AUC0-∞為(37.41±14.42)μg·mL-1·h，t1/2為(7.53±8.01)h，CL/F為(29.36±7.78)L·h-1，Vd為(258.80±177.96)L。30例患者按0.5 g ,q12h劑量服用MMF至少7 d后血漿MPA穩(wěn)態(tài)谷濃度的分布見圖3，MPA穩(wěn)態(tài)谷濃度在0.37～3.83(1.48±0.88)μg·mL-1之間波動，個體間變異高達59.2%，提示有必要在該人群中開展MPA治療藥物濃度監(jiān)測。

表1 LC-MS/MS測定MPA的準確度和精密度

圖2 6例心臟移植患者單次給藥后MPA藥-時曲線

圖3 30例心臟移植患者血漿MPA穩(wěn)態(tài)谷濃度分布

3 討論

MMF是目前器官移植術(shù)后常用的免疫抑制藥，常與鈣調(diào)磷酸酶類抑制劑(CNI)和糖皮質(zhì)激素組成三聯(lián)免疫抑制治療方案。MMF需在體內(nèi)代謝為活性的MPA才能發(fā)揮作用，而體內(nèi)MPA暴露水平與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生具有顯著的相關(guān)性。研究顯示，MPA與環(huán)孢素A合用時谷濃度應(yīng)維持在1.0～3.5 μg·mL-1，與他克莫司聯(lián)用谷濃度應(yīng)維持在1.9～4.0 μg·mL-1；與環(huán)孢素或他克莫司聯(lián)用時AUC0～12 h都應(yīng)維持在30～60 μg·mL-1·h[16]。然而，MPA個體差異大，受多方面因素(如患者病情、體內(nèi)白蛋白水平、飲食、肝功能等)的影響，難以保證MPA暴露量維持在目標水平內(nèi)。因此，開展MPA的TDM具有十分重要的臨床意義。

目前，臨床常用的MPA檢測方法主要基于免疫原理，如酶放大免疫技術(shù)(enzyme multiplied immunoassay technology，EMIT)[17]。該方法有商品化試劑盒，樣本檢測方便快捷，適用于MPA的常規(guī)監(jiān)測。但該方法存在著缺點，如檢測的特異性不高，存在交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果容易受代謝物以及相似物質(zhì)的干擾，使得檢測結(jié)果偏高[18]。另外，該方法MPA的線性范圍在0.1～15 μg·mL-1[17]，常常會導(dǎo)致某些患者峰濃度值超出檢測限，適用性差。因此，采用治療藥物監(jiān)測(TDM)檢測的金標準LC-MS/MS法建立一種適用于臨床MPA檢測及藥動學(xué)研究的方法十分必要。目前，國內(nèi)外已有許多關(guān)于LC-MS/MS法檢測MPA的報道[19]，檢測方法各具優(yōu)缺點，如許多文獻采用在線固相萃取技術(shù)進行樣本前處理，成本高；定量范圍窄(<20 μg·mL-1)難以滿足臨床檢測需求；流動相成分復(fù)雜等特點。而本文建立的方法最大特點在于樣本前處理僅采用乙腈沉淀蛋白，高速離心后進樣分析，整個操作過程簡單方便、樣本分析時間短、流動相成分簡單、檢測范圍可滿足臨床檢測需求。

MMF在健康人、腎移植、肝移植患者體內(nèi)的藥動學(xué)研究已有諸多報道[8-10,20]，但在心臟移植患者中藥動學(xué)資料還很少。本研究將建立的方法用于心臟移植患者單次服用MMF的藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn)MPA藥動學(xué)在心臟移植患者中存在較大個體差異，單次給藥后腸肝循環(huán)不明顯。此外，筆者還將此方法用于30例心臟移植患者MPA穩(wěn)態(tài)谷濃度的測定，發(fā)現(xiàn)服用MMF 0.5 g，q12h達穩(wěn)態(tài)后MPA濃度均在1.48 μg·mL-1，此結(jié)果高于DENOFRIO 等[21]報道聯(lián)用1 g,q12h MMF和環(huán)孢素A達穩(wěn)態(tài)后MPA谷濃度均值為1.2 μg·mL-1。本研究結(jié)果偏高的原因可能為合并使用環(huán)孢素A時，因為環(huán)孢素A干擾MPA的肝腸循環(huán)，可將MPA降低30%～50%；合并使用他克莫司時則不干擾MPA代謝。目前，心臟移植患者合并使用MMF和他克莫司后，MPA藥動學(xué)以及藥動學(xué)參數(shù)與臨床療效的關(guān)系尚不明確，期望未來的研究中通過本中心病例積累能得到MPA藥動學(xué)變化規(guī)律并制定出適宜的心臟移植患者MPA治療窗，為推進該人群個體化治療做出積極貢獻。