肖俊勇，李力，從仁懷，劉宏

(1.華中科技大學(xué)無(wú)限極現(xiàn)代制劑技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075；2.武漢藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司，武漢 430075；3.國(guó)家納米藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430075)

肉豆蔻是肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥種仁[1]，又稱肉果、玉果，俗稱肉蔻。主要產(chǎn)地有馬來(lái)西亞、印度尼西亞等，我國(guó)海南、云南、廣東等地亦有栽培，但因氣候不適以及收益期長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)肉豆蔻主要源于進(jìn)口[2-3]。肉豆蔻種仁入藥，可治虛瀉冷痢、脘腹冷痛、嘔吐、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗抑郁、抗癌以及降血糖血脂等[4]，外用可作寄生蟲(chóng)驅(qū)除劑，治療風(fēng)濕痛等。肉豆蔻主要活性成分為揮發(fā)油[5]，其揮發(fā)油中化學(xué)成分主要是單萜類和芳香類化合物。

中藥譜效學(xué)是在中醫(yī)藥理論現(xiàn)代研究的基礎(chǔ)上，以中藥指紋圖譜為基礎(chǔ)，以效應(yīng)及效應(yīng)體學(xué)為主要內(nèi)容，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，建立中藥指紋圖譜與中藥質(zhì)量療效內(nèi)在關(guān)系的一門學(xué)科[6]。中藥成分復(fù)雜，對(duì)疾病的治療往往是多種成分通過(guò)多靶點(diǎn)和多環(huán)節(jié)發(fā)揮整體作用，單一藥效指標(biāo)難以全面反映中藥的藥效信息[7]。因此，隨著中藥譜效學(xué)研究的逐漸深入，新的中藥多維譜效關(guān)系研究方法和模式逐漸形成，即選擇先進(jìn)的分析手段對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行多維分析以及盡可能多的選擇與療效密切相關(guān)的多種藥效指標(biāo)探討譜效關(guān)系。目前筆者尚未見(jiàn)肉豆蔻揮發(fā)油緩解慢性炎性疼痛譜效關(guān)系的報(bào)道，因此，筆者運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油緩解慢性炎性疼痛的譜效關(guān)系進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠132只，體質(zhì)量150～200 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，合格證編號(hào)No.42000600025917。

1.2材料 肉豆蔻揮發(fā)油(課題組前期提取分離獲得的19個(gè)揮發(fā)油，S1-S19)，雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS，Aladdin公司，含量≥99%，批號(hào)：K1702042)；無(wú)水乙醇(含量≥99.7%，批號(hào)：20160928)，二甲苯(含量≥99.0%，批號(hào)：20160929)，包埋石蠟(批號(hào)：20170303)，中性樹(shù)膠(批號(hào)：88000109)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抗體，均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；神經(jīng)激肽-1受體(neurokinin-1 receptor ，NK-1R)抗體(Millipore公司)；大鼠P物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(Abbkine公司)。

1.3儀器 7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，HP-5MS氣相毛細(xì)管柱(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，ZH-200熱刺痛儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，ZH-ZZY足趾容積測(cè)量?jī)x(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，C2500-R-230V微型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet)，ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE)，Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo scientific)，RM2016病理切片機(jī)(德國(guó)Leica)，JK-6組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，BX53顯微鏡[成貫儀器(上海)有限公司]。

1.4GC-MS檢測(cè)方法 采用頂空進(jìn)樣方法：稱取肉豆蔻揮發(fā)油0.5 g，置于10 mL專用頂空瓶中，采用CTC PAL自動(dòng)進(jìn)樣器，80 ℃平衡15 min；GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣：氦氣，載氣流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量500 μL，分流比50：1。采用程序升溫：初始溫度40 ℃(保持2 min)，6 ℃·min-1升溫速率升至240 ℃(保持2 min)；質(zhì)譜(MS)條件：離子源EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，倍增管電壓：1.2 kV，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍50～550。

1.5肉豆蔻揮發(fā)油指紋圖譜的建立及相似度分析 將19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油樣品的GC-MS檢測(cè)結(jié)果采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)進(jìn)行分析。

1.6藥效實(shí)驗(yàn)

1.6.1慢性炎性疼痛模型的建立 于Wistar大鼠右后肢足底中部皮下注射完全弗氏佐劑0.15 mL，建立慢性炎性疼痛模型。

1.6.2動(dòng)物分組及給藥 取大鼠132只，隨機(jī)分成22組，每組6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分別為空白對(duì)照組(于大鼠右后肢足底中部皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.15 mL)、模型對(duì)照組、雙氯芬酸鈉組(雙氯芬酸鈉2.5 mg·kg-1)、模型+肉豆蔻揮發(fā)油組(19組，30 mg·kg-1)?？瞻讓?duì)照組及模型對(duì)照組每天灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，雙氯芬酸鈉組每天灌胃給予相應(yīng)劑量的雙氯芬酸鈉，肉豆蔻揮發(fā)油組每天灌胃給予相應(yīng)劑量的肉豆蔻揮發(fā)油。

1.6.3足趾腫脹程度 分別于第0，1，3，5，7，14，21，28天用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠造模腳(右腳)腳掌的腫脹程度。

1.6.4輻射熱痛覺(jué)閾值 分別于第0，1，3，5，7，14，21，28天用熱刺痛儀測(cè)定大鼠造模腳(右腳)的輻射熱痛覺(jué)閾值。

1.6.5NK-1R、COX-2檢測(cè) 動(dòng)物造模、分組及給藥同“1.6.1”和“1.6.2”項(xiàng)，于第4周進(jìn)行樣本采集。解剖大鼠，取第 5 腰椎背根神經(jīng)節(jié)，10%中性甲醛室溫固定，制備石蠟切片。按SABC法免疫組織化學(xué)染色操作步驟進(jìn)行 NK-1R、COX-2 的免疫組織化學(xué)染色，鏡檢，測(cè)定NK-1R、COX-2。

1.6.6P物質(zhì)檢測(cè) 動(dòng)物造模、分組及給藥同“1.6.1”和“1.6.2”項(xiàng)，于第4周進(jìn)行樣本采集。頸部取血，靜置，離心(3500 r·min-1，5 min)，取上清液，-80 ℃保存，采用ELISA法檢測(cè)血液中 P 物質(zhì)含量。

1.7灰色關(guān)聯(lián)度分析法分析譜效關(guān)系 根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度算法，本文以19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油的26個(gè)共有特征峰作為比較數(shù)列(子序列)，構(gòu)成26個(gè)子序列記為[Xi(k)]，以肉豆蔻揮發(fā)油樣品藥效學(xué)指標(biāo)足趾腫脹程度、輻射熱痛覺(jué)閾值、P物質(zhì)、NK-1R和COX-2作為參考序列(母序列)記為[X0(k)]，計(jì)算[X0(k)]與[Xi(k)]的關(guān)聯(lián)度并排序。

2 結(jié)果

2.1肉豆蔻揮發(fā)油指紋圖譜的建立及相似度分析結(jié)果 分析得對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖1，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油指紋圖譜見(jiàn)圖2，相似度結(jié)果見(jiàn)表1，各特征共有峰的面積見(jiàn)表2。根據(jù)表1結(jié)果發(fā)現(xiàn)各樣品之間兩兩比較相似度為0.008～0.999，其中S5、S6、S14和S18這4個(gè)樣品與其他樣品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相似度均小于0.700。19種肉豆蔻揮發(fā)油之間存在差異，可作為譜效分析的樣品。根據(jù)肉豆蔻揮發(fā)油指紋圖譜分析得26個(gè)特征共有峰，由表2可知，其峰面積之和均占各樣品總峰面積的87.00%～99.98%，可較好代表該樣品。

圖1 肉豆蔻揮發(fā)油的對(duì)照指紋圖譜

圖2 肉豆蔻揮發(fā)油指紋圖譜

表1 不同肉豆蔻揮發(fā)油相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

表2 GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積

續(xù)表2 GC-MS指紋圖譜共有峰峰面積

2.2足趾腫脹程度測(cè)量結(jié)果 大鼠造模腳(右腳)的腫脹程度結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：右腳變化較為明顯，與空白對(duì)照組比較，給藥后第1天給予完全弗氏佐劑的大鼠均有明顯腫脹；給藥后第3天，模型對(duì)照組依然明顯腫脹，而各給藥組均有不同程度的緩解，其中S3、S4、S6、S7、S8、S15、S16和S19組消腫效果顯著，均優(yōu)于雙氯芬酸鈉組；給藥后第5，7，14，21天模型對(duì)照組與各給藥組具有不同程度的緩解；給藥后第28天，各給藥組緩解程度均優(yōu)于模型對(duì)照組，其中S3和S4組消腫效果最好，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油給藥組中僅S2組消腫效果弱于雙氯芬酸鈉組，緩解程度順序?yàn)镾3≈S4>S6≈S9≈S19>S1>S7≈S18>S17>S14≈S13>S12>S5>S10>S8≈S16≈S11=S15>雙氯芬酸鈉>S2。

2.3輻射熱痛覺(jué)閾值測(cè)量結(jié)果 大鼠造模腳(右腳)的熱痛覺(jué)閾值結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，與空白對(duì)照組比較，給藥后第1天給予完全弗氏佐劑的大鼠的熱痛覺(jué)閾值均明顯降低；給藥后第3天，模型對(duì)照組和各給藥組的熱痛覺(jué)閾值均有不同程度的回升，各給藥組的回升程度均高于模型對(duì)照組，其中S5、S15、S18、S19和雙氯芬酸鈉組的熱痛覺(jué)閾值回升程度顯著。給藥后第14，21天，各給藥組熱痛覺(jué)閾值回升程度均高于模型對(duì)照組，其中S4組緩解疼痛的效果顯著。給藥后第28天，除S17、S18組外其他各給藥組熱痛覺(jué)閾值回升程度均高于模型對(duì)照組，其中S4組緩解疼痛效果最好，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油給藥組中S1、S13、S19、S8、S9、S18和S17組緩解效果弱于雙氯芬酸鈉組，緩解順序?yàn)镾4>S6>S15≈S11>S7>S14>S16>S2>S5>S3>S10>S12≈雙氯芬酸鈉>S1≈S13>S19>S8>S9>模型對(duì)照>S18>S17。

表3 大鼠右腳腫脹程度

表4 大鼠右腳熱痛覺(jué)閾值

2.4NK-1R、COX-2檢測(cè) 大鼠第五腰椎背根神經(jīng)節(jié)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)的NK-1R和COX-2的平均吸光度見(jiàn)表5。由表5可知，給藥后第4周，各給藥組間NK-1R和COX-2的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的改變，通過(guò)比較分析可知，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組NK-1R表達(dá)量顯著升高；與模型對(duì)照組比較，各給藥組NK-1R表達(dá)量均有不同程度的降低，其中S5-S17組顯著降低(P<0.01)；各給藥組NK-1R表達(dá)量降低程度順序?yàn)镾13>S11>S7>S10>S8>S9>S15>S17>S12>S16>S14>空白對(duì)照>S6>S5>S19>S18>S2>S3=S4>S1>模型對(duì)照>雙氯芬酸鈉，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油給藥組NK-1R表達(dá)量降低程度均優(yōu)于雙氯芬酸鈉組。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組COX-2表達(dá)量顯著升高；與模型對(duì)照組比較，各給藥組COX-2表達(dá)量均有不同程度的降低，其中S5、S7、S8、S12、S16和S17組顯著降低(P<0.01)；各給藥組COX-2表達(dá)量降低程度順序?yàn)镾5>S7>S16>S8>S12>S17>S18>空白對(duì)照>S13>S11>S3>S15>S9>S10>S6>S2>S4>S14>雙氯芬酸鈉>S19>S1>模型對(duì)照，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油給藥組中S19和S1組的COX-2表達(dá)量降低程度低于雙氯芬酸鈉組。

2.5P物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 大鼠血液中P物質(zhì)的釋放量結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：給藥后第4周，各給藥組間P物質(zhì)釋放量均出現(xiàn)不同程度的改變，通過(guò)比較分析可知各給藥組P物質(zhì)釋放量降低程度順序?yàn)镾6>S16>S14>S13>S19>S18>S12>S10>S11>S17>S8>DS>S15≈S2>S9>模型對(duì)照>S3>S4>S5>S1>S7，19個(gè)肉豆蔻揮發(fā)油給藥組中S15、S2、S9、S3、S4、S5、S1和S7組的P物質(zhì)釋放量降低程度低于雙氯芬酸鈉組，S3、S4、S5、S1和S7的P物質(zhì)釋放量高于模型對(duì)照組。

2.6灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果 關(guān)聯(lián)度匯總結(jié)果見(jiàn)表6，關(guān)聯(lián)序匯總結(jié)果見(jiàn)表7。由表6和表7可知，26個(gè)特征共有峰對(duì)各藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)和總藥效的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，其中關(guān)聯(lián)度最高的前五位峰為6號(hào)峰>8號(hào)峰>9號(hào)峰>5號(hào)峰>12號(hào)峰，可見(jiàn)肉豆蔻揮發(fā)油緩解慢性炎性疼痛效果是其有效物質(zhì)成分群共同作用的結(jié)果。

表5 NK-1R和COX-2的平均吸光度和血液中P物質(zhì)

3 討論

慢性炎性疼痛是全世界的重要健康問(wèn)題之一，它嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，每年用于慢性炎性疼痛的治療費(fèi)用很大程度加重公共醫(yī)療的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8-9]。因此，如何有效地緩解慢性炎性疼痛是亟需解決的問(wèn)題。用于慢性炎性疼痛治療的藥物主要有苯二氮類藥物、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)拮抗劑、非甾體類抗炎藥物和阿片類藥物等[10-13]，這些藥物有一定的緩解慢性炎性疼痛效果，但因其副作用而應(yīng)用受到限制。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)中草藥是緩解和治療慢性炎性疼痛的有效途徑[14]，如肉豆蔻揮發(fā)油可通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)和降低血液中P物質(zhì)的釋放來(lái)緩解完全弗氏佐劑所致慢性炎性疼痛[15]。背根神經(jīng)節(jié)作為痛覺(jué)傳導(dǎo)的初級(jí)神經(jīng)元，近年來(lái)已成為疼痛治療的重要研究靶點(diǎn)[16]。炎性遞質(zhì)COX-2、NK-1R和P物質(zhì)等本身又是致痛物質(zhì)，在炎癥反應(yīng)和疼痛傳導(dǎo)過(guò)程中均產(chǎn)生重要作用。因此，本研究綜合足趾腫脹程度、輻射熱痛覺(jué)閾值、第五腰椎背根神經(jīng)節(jié)中NK-1R、COX-2的表達(dá)以及血液中P物質(zhì)的釋放這5個(gè)指標(biāo)對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油的藥效學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表6 關(guān)聯(lián)度匯總結(jié)果

目前，用于中藥譜效學(xué)的分析方法主要有灰色關(guān)聯(lián)度分析法、回歸分析和相關(guān)分析等。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜和各藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)以及總藥效進(jìn)行綜合分析，此分析方法對(duì)數(shù)據(jù)要求較低，可分析小樣本[17]。由于數(shù)列單位不同或量綱不同，在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析之前，需要對(duì)各數(shù)列進(jìn)行無(wú)量綱化處理。本研究釆用均值化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，可盡量避免兩端值的影響而造成的數(shù)據(jù)失真，降低無(wú)量綱化處理對(duì)結(jié)果的影響。

表4中第28天模型對(duì)照組與空白對(duì)照組和各給藥組比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡苁且?yàn)榄h(huán)境溫度極低導(dǎo)致室溫達(dá)不到恒溫要求，從而影響大鼠腳底熱痛覺(jué)閾值。因此，后期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制室溫恒溫。表5中各組之間P物質(zhì)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)條件分析，可能與大鼠處死時(shí)環(huán)境溫度過(guò)低，從而影響大鼠血液中P物質(zhì)的釋放和分布有關(guān)。

表7 關(guān)聯(lián)序匯總結(jié)果

綜上所述，不同的肉豆蔻揮發(fā)油對(duì)足趾腫脹、熱痛、NK-1R表達(dá)、COX-2表達(dá)和P物質(zhì)的釋放均有不同程度的緩解，大部分肉豆蔻揮發(fā)油樣品緩解慢性炎性疼痛的效果均優(yōu)于模型對(duì)照組，說(shuō)明肉豆蔻揮發(fā)油具有緩解慢性炎性疼痛的作用。肉豆蔻緩解慢性炎性疼痛作用是其有效物質(zhì)成分群——26個(gè)特征共有峰代表的化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，雖然各特征共有峰代表的化學(xué)成分與各藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)和總藥效的關(guān)聯(lián)度大小不同，但都是肉豆蔻揮發(fā)油緩解慢性炎性疼痛的有效成分，其中與緩解慢性炎性疼痛關(guān)聯(lián)度最高的前五位峰為6號(hào)峰>8號(hào)峰>9號(hào)峰>5號(hào)峰>12號(hào)峰。本研究為以有效成分為基礎(chǔ)的中藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考依據(jù)，后期可對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油緩解慢性炎性疼痛譜效關(guān)系深入研究，對(duì)其有效物質(zhì)成分群中的成分進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定。