青旺旺, 施宇濤, 楊 林, 張芮騰, 張景勍, 何 丹*

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 重慶 400016; 2. 重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院, 重慶 401331)

沉香化氣片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第七冊[1],全方由沉香、木香、廣藿香、香附、砂仁、陳皮等10味藥組成,具有理氣疏肝、消積和胃的功效,用于治療肝胃氣滯、脘腹脹痛、胸膈痞滿、不思飲食、噯氣泛酸。其中木香、廣藿香、砂仁和陳皮4味藥材蒸餾提取揮發(fā)油后入藥。廣藿香揮發(fā)油具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)咳及調(diào)節(jié)胃腸道的功能[2,3],百秋李醇為廣藿香的主要揮發(fā)性成分,也是廣藿香質(zhì)量評價的指標(biāo)成分;砂仁揮發(fā)油具有明顯的消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、促進(jìn)胃腸運(yùn)動等多方面的功效[4],其主要成分為樟腦和乙酸龍腦酯;陳皮性溫、味苦、辛,陳皮揮發(fā)油具有很好的促胃動力作用[5]。沉香化氣片中的揮發(fā)性成分具有良好的藥理作用,但目前沉香化氣片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和顯微鑒別項(xiàng),而國內(nèi)外關(guān)于沉香化氣片含量測定的文獻(xiàn)報道多見于采用高效液相色譜法測定橙皮苷的含量和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定百秋李醇、樟腦、乙酸龍腦酯等成分的含量[6-9],同時也有采用超高效液相色譜法建立沉香化氣丸的指紋圖譜[10],但采用氣相色譜法建立沉香化氣片中揮發(fā)性成分的氣相色譜指紋圖譜的文獻(xiàn)尚未見報道,難以全面體現(xiàn)其質(zhì)量的優(yōu)劣。因此,有必要建立沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜。

中藥復(fù)方制劑具有組成藥材多、組成成分復(fù)雜的特點(diǎn),中藥指紋圖譜能夠充分提取中藥制劑中的化學(xué)成分信息,具有整體性和全面性,通過指紋圖譜方法能在一定程度上反映復(fù)方的內(nèi)在質(zhì)量[11-13],而化學(xué)模式識別既可以對指紋圖譜的信息進(jìn)行識別、處理,又可以將多個指標(biāo)進(jìn)行綜合、降維和分類分析,從而更加客觀、科學(xué)地反映中藥制劑的質(zhì)量信息,最終達(dá)到全面控制該制劑的整體質(zhì)量的目的[14,15]。本實(shí)驗(yàn)擬建立沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜,并結(jié)合相似度評價和化學(xué)模式識別,為該制劑的質(zhì)量控制與評價提供科學(xué)的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜儀(GC-2010)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-TQ8040)配電子轟擊(EI)源(日本島津公司); 1/10萬電子分析天平(SQP,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ-2200B,昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司), Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱(美國Agilent公司)。

甲醇(色譜純,美國天地有限公司),乙醇(分析純,重慶川東化工集團(tuán)有限公司), D-檸檬烯對照品(純度>98%,批號Z28D8H51809,上海源葉生物科技有限公司),乙酸龍腦酯對照品和百秋李醇對照品(純度均>98%,批號分別為MUST-18022605和MUST-17073111,成都曼斯特生物科技有限公司),正十八烷(純度>99%,批號G9814,山東西亞化學(xué)股份有限公司), 20批沉香化氣片(批號分別為18030026、18020015、18010007、18020013、18030029、18030024、18020012、18030019、18030023、17120095、18040031、18020016、18030022、18030027、17070058、18040033、18010006、18040030、18030021和17060049,依次記為S1～S20,太極集團(tuán))。

1.2 對照溶液的制備

內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取正十八烷適量,加甲醇制得濃度為32.6 mg/L的正十八烷內(nèi)標(biāo)溶液。

對照品溶液:精密稱取D-檸檬烯、乙酸龍腦酯、百秋李醇對照品適量,加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為61.54、37.5和53.3 mg/L的對照品溶液,即得。

1.3 供試品溶液的制備

取10片沉香化氣片,研勻,精密稱定0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入10 mL乙醇,稱量,超聲(頻率40 Hz,功率100 W)處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用乙醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻,靜置,取上清液經(jīng)濾紙濾過,將濾液過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜,取續(xù)濾液1 mL置于5 mL量瓶中,精密加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)溶液,加乙醇至刻度,搖勻,即得。

1.4 色譜條件

1.4.1氣相色譜條件

色譜柱:Agilent DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)柱;載氣:氮?dú)?進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣模式:分流;分流比:5∶1。程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持2 min,以2.5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,保持10 min。平衡時間:3 min; FID檢測器溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:200 ℃;接口溫度:250 ℃;載氣:氦氣;溶劑延遲:2.5 min;掃描范圍:m/z45～500。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)參照峰的選擇

選擇在氣相色譜儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上檢測性質(zhì)穩(wěn)定、定量準(zhǔn)確、易于獲得的烷烴。以正十八烷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析,所得譜圖與樣品譜圖重疊比較,對共有峰無干擾,選擇正十八烷為內(nèi)標(biāo)參照峰,如圖1所示。

圖 1 (a)正十八烷及(b)沉香化氣片樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of (a) the n-octadecane and (b) the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos. 1-11: components 1-11; T: n-octadecane.

2.2 樣品提取方法的考察

樣品以超聲提取法、回流提取法、冷浸法進(jìn)行提取,根據(jù)各成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),發(fā)現(xiàn)超聲提取法和回流提取法均優(yōu)于冷浸法,考慮到一些揮發(fā)性成分的熱不穩(wěn)定,且超聲提取法簡便快捷,故選擇超聲提取法。對提取溶劑(甲醇、乙醇、水、30%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇、50%甲醇和80%甲醇)進(jìn)行考察,結(jié)果表明乙醇對待測成分的提取優(yōu)于甲醇,故選擇乙醇為提取溶劑。對提取時間(30、45和60 min)進(jìn)行了考察,結(jié)果表明提取時間≥45 min時,提取效果無明顯差異,故選擇提取時間為45 min。

2.3 含量測定

分別精密吸取適量對照品溶液和適量內(nèi)標(biāo)溶液,加甲醇稀釋成6個不同水平濃度的對照品溶液,按1.4.1節(jié)方法進(jìn)樣測定,3個組分在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.999。以3個組分的峰面積RSD來評價定量分析的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性,RSD均小于3%,滿足定量分析的要求。20批樣品中,D-檸檬烯的含量為0.802～5.490 mg/g,乙酸龍腦酯的含量為0.074～0.218 mg/g,百秋李醇的含量為0.140～0.732 mg/g。各組分含量的差異可能是所用原藥材的成分波動和生產(chǎn)過程的波動所導(dǎo)致的。

2.4 氣相指紋圖譜的分析

2.4.1方法學(xué)考察

在精密度試驗(yàn)中,精密吸取1 μL S1樣品供試品溶液,按1.4.1節(jié)方法連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄氣相色譜圖。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中,分別在S1樣品供試品溶液制備后0、2、4、8、12和24 h精密吸取1 μL,按1.4.1節(jié)方法進(jìn)樣測定,記錄氣相色譜圖。在重復(fù)性試驗(yàn)中,取S1樣品,按供試品溶液制備方法平行制備6份,分別精密吸取1 μL,按1.4.1節(jié)方法進(jìn)樣測定,記錄氣相色譜圖。分別計算精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)各共有峰相對于參照峰(內(nèi)標(biāo)峰)的相對保留時間和相對峰面積。

精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)的各共有峰相對保留時間RSDs和相對峰面積的RSDs的結(jié)果分別為小于1%和小于3%、小于1%和小于3%、小于1%和小于4%。將精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)的圖譜分別采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)進(jìn)行處理,精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)分別6次進(jìn)樣的圖譜與對照圖譜相似度均不小于0.99,因此,表明儀器精密度良好,供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,該方法的重復(fù)性良好。

圖 2 20批沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig. 2 Gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets and the reference fingerprint (R) S1-S20: sample 1-20.

2.4.2氣相色譜指紋圖譜的建立

取20批沉香化氣片樣品,按供試品溶液制備方法制備溶液,按1.4.1節(jié)方法進(jìn)樣測定,記錄氣相色譜圖。對所有色譜圖進(jìn)行統(tǒng)一積分后,將所得圖譜以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)軟件進(jìn)行處理,對照圖譜的生成方法為中位數(shù)法,時間窗寬度為0.1,運(yùn)用多點(diǎn)校正方法對色譜圖進(jìn)行全峰匹配,生成對照指紋圖譜(R)和20批樣品的氣相色譜指紋圖譜圖(見圖2),確定了11個共有峰。

2.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對指紋圖譜峰定性

應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對沉香化氣片指紋圖譜中的11個共有峰進(jìn)行了初步定性,氣相色譜-質(zhì)譜條件見1.4節(jié),沉香化氣片樣品的總離子流色譜圖見圖3,再利用計算機(jī)內(nèi)解卷積軟件[16,17]及匹配NIST14質(zhì)譜庫,最終經(jīng)對照品比對、NIST14譜庫檢索和文獻(xiàn)檢索,對其中了10個成分進(jìn)行了指認(rèn),對應(yīng)氣相色譜圖中的8號峰未能指認(rèn),結(jié)果見表1。

2.6 指紋圖譜的相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)軟件,將S1樣品的色譜圖作為參照圖譜,計算20批沉香化氣片指紋圖譜的相似度。結(jié)果各共有峰保留時間的RSDs均<0.14%,各共有峰峰面積的RSDs相差較大,20批樣品的相似度為0.952～0.999,相似度結(jié)果見表2。表明沉香化氣片的化學(xué)組成成分相似,但各批次間共有峰成分含量差異較大,如需要更為客觀地反映沉香化氣片的內(nèi)在質(zhì)量,須進(jìn)行化學(xué)模式識別。

圖 3 沉香化氣片樣品的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of the Chenxianghuaqi tablet sample Peak Nos: 1. D-limonene; 2. camphor; 3. bornyl acetate; 4. 4,7-methanoazulene; 5. α-bulnesene; 6. patchouli alcohol; 7. n-hexadecanoic acid; 9. octadecanoic acid; 10. pentafluoropropionyl-L-prolin-pentyl ester; 11. triphenylphosphine oxide.

表 1 氣相色譜指紋圖譜中10個共有峰的指認(rèn)Table 1 Identification of the 10 common peaks in gas chromatographic fingerprints

Standard: standard products.

表 2 20批沉香化氣片氣相色譜指紋圖譜相似度結(jié)果Table 2 Similarity results for the gas chromatographic fingerprints of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

2.7 化學(xué)模式識別

2.7.1聚類分析

將20批樣品的11個共有峰的絕對峰面積作為變量,得到20×11階原始數(shù)據(jù)矩陣,導(dǎo)入SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件中,選取組間連接法,以歐式距離作為樣品測定,計算樣品的相似性程度,對樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖4。

圖 4 20批沉香化氣片的聚類分析樹狀圖Fig. 4 Cluster analysis dendrogram of the 20 batches of Chenxianghuaqi tablets

由圖4可知,20批樣品聚為2類,樣品S17、S4、S3、S10、S14、S16、S19、S1、S2、S6、S8、S7、S20、S15聚為1類,樣品S18、S13、S9、S5、S12、S11聚為1類。第1類樣品批次生產(chǎn)日期差異較大,第2類樣品批次生產(chǎn)日期較為接近,因此聚為一類。在制劑的生產(chǎn)過程中,其質(zhì)量穩(wěn)定性受到多種因素共同影響,不同的生產(chǎn)時間是導(dǎo)致制劑質(zhì)量差異的重要因素之一。主要原因可能是原藥材采摘季節(jié)不同以及不同時間的車間生產(chǎn)工藝、質(zhì)量體系均會產(chǎn)生不同的影響,因此導(dǎo)致制劑批次之間的質(zhì)量也會有所差異。

圖 5 沉香化氣片的主成分分析得分圖Fig. 5 Scores of principal component analysis for Chenxianghuaqi tablets

2.7.2主成分分析

圖 6 沉香化氣片的主成分載荷圖Fig. 6 Loading plot of principal component for Chenxianghuaqi tablets Nos. are the same as those in Fig. 3

將20批樣品的11個共有峰的峰面積輸入Excel表格內(nèi),得到20×11列數(shù)據(jù)矩陣,導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件中進(jìn)行主成分分析,得到前3個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為86.4%,超過85%,沉香化氣片的主成分分析得分圖和載荷散點(diǎn)圖,見圖5和圖6。由圖5可知,20批沉香化氣片樣品可分為為2組,樣品S15、S16、S1、S19、S3、S10、S2、S4、S14、S7聚為1類,樣品S20、S17、S8、S18、S6、S9、S5、S13、S11、S12聚為1類。由圖6可知,載荷散點(diǎn)圖中每一個點(diǎn)代表一個色譜峰,表示每個色譜峰對主成分綜合作用的貢獻(xiàn),距離載荷圖原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量,權(quán)重越大,代表該色譜峰對樣本整體分布所起的作用就越大,圖中1號(D-檸檬烯)、2號(樟腦)、3號(乙酸龍腦酯)、4號(4,7-methanoazulene)、5號(α-布藜烯)色譜峰在坐標(biāo)系中的絕對值較大,表明其對藥物的整體質(zhì)量起主要作用。

3 結(jié)論

本文建立了沉香化氣片的氣相色譜指紋圖譜,確定了11個共有峰,并測定了其中3個組分的含量,結(jié)合化學(xué)模式識別評價20批樣品的質(zhì)量。20批樣品的相似度均大于0.9,為了更客觀地反映沉香化氣片的內(nèi)在質(zhì)量,采用各指標(biāo)成分的峰面積進(jìn)行不同批次樣本的化學(xué)模式識別,可用于批次間的區(qū)分和歸類,主要將20批樣品分為2類,主成分分析結(jié)果能夠反映20種樣本的色譜圖直觀結(jié)果,找到了引起不同批次間質(zhì)量差異的主要成分為D-檸檬烯、樟腦、乙酸龍腦酯、4,7-methanoazulene、α-布藜烯。以上結(jié)果表明氣相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別為沉香化氣片的質(zhì)量控制提供簡單、可靠的方法。