魏忠偉 鄭配國(guó) 李付廣#

（1 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河南鄭州 450001；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 河南鄭州 450052）

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG）是髓鞘膜和少突膠質(zhì)細(xì)胞表面最外層的膜蛋白，具有高度免疫原性，直接參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)體液免疫，是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis,EAE）患者發(fā)生脫髓鞘改變的主要免疫靶點(diǎn)。多發(fā)性硬化（Multiple Sclerosis,MS）是一種主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性脫髓鞘疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎可以作為多發(fā)性硬化的理想動(dòng)物模型，兩者具有相似的病理學(xué)特征和脫髓鞘改變[1]。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MS 實(shí)質(zhì)是自身免疫性疾病[2]，發(fā)病可能與病毒感染、環(huán)境、遺傳因素以及免疫學(xué)因素有關(guān)，其中免疫學(xué)因素起著關(guān)鍵作用[3]。即使目前對(duì)于控制MS 病情已經(jīng)有許多方法，但是根治性治療的藥物尚未發(fā)現(xiàn)[4]。我們團(tuán)隊(duì)的前期研究顯示，MOG35-55 多肽可以緩解實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的癥狀，使臨床評(píng)分降低，且T 淋巴細(xì)胞定向遷移可以誘導(dǎo)小鼠胸腺萎縮[5]。在本次研究中，我們制備實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠模型，并予MOG35-55，觀(guān)察中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾效應(yīng)性T 細(xì)胞（Effector T Cell,Teff）的表達(dá)變化，探討MOG35-55 預(yù)防實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的免疫學(xué)機(jī)制，以為臨床治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 小鼠共50 只，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：11400700058264）。小鼠飼養(yǎng)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。每天觀(guān)察小鼠狀態(tài)。

1.2 試劑與儀器 MOG35-55 溶液（1.50 mg/ml）購(gòu)自上海吉爾生化公司，不完全弗氏佐劑和熱滅活的結(jié)核分支桿菌溶液（5 mg/ml）由美國(guó)BD Difco 公司提供，百日咳毒素（Pertussis Toxin,PT）由北京聯(lián)立信生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。Anti-CD4-FITC、Anti-CD8-PE、Anti-CD44-APC、Anti-CD62L-PreCP等流式抗體由eBioscience 公司提供，Mouse IFN-γ ELISA assay kit、Mouse TNF-α ELISA assay kit、Mouse IL-17 ELISA assay kit 購(gòu)買(mǎi)于R&D Systems公司。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備（1）動(dòng)物分組：50 只C57BL/6 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抓取45 只制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型，余5 只為空白對(duì)照組（對(duì)照組）。（2）模型制備：將MOG35-55 溶液與滅活的結(jié)核桿菌素溶液以體積比1:1 充分混合乳化，EAE 組小鼠于雙側(cè)背部皮下注射200 μl，注射當(dāng)天和注射第2 天于尾靜脈注射百日咳毒素200 μg，制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型。模型小鼠的病程特點(diǎn)為進(jìn)展期病情進(jìn)展迅速，發(fā)病高峰期臨床評(píng)分穩(wěn)定且維持3 d 不變?yōu)闇?zhǔn)。第6 天開(kāi)始給予模型小鼠MOG35-55 多肽[50 μg/200 μl 磷酸鹽緩沖液（PBS）]，隨機(jī)抓取20 只小鼠作為MOG 組，每天一次性腹腔注射，連續(xù)注射10 d。剩余的25 只小鼠不做處理，為EAE 組。對(duì)照組小鼠僅于雙側(cè)背部皮下注射PBS 200 μl，注射當(dāng)天和注射第2 天于尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液200 μl。

1.4 臨床評(píng)分 采用Kono's 5 分法對(duì)小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分[6]，從第2 天開(kāi)始每天觀(guān)察小鼠并記錄小鼠狀態(tài)。0 分，正常，無(wú)臨床癥狀；0.5 分，尾部部分癱瘓；1 分，尾部完全癱瘓；1.5 分，單側(cè)后肢無(wú)力；2 分，雙側(cè)后肢無(wú)力；2.5 分，單側(cè)后肢癱瘓；3 分，雙側(cè)后肢完全癱瘓；3.5 分，雙側(cè)后肢完全癱瘓，單側(cè)前肢癱瘓；4 分，四肢完全癱瘓；4.5 分，瀕死狀態(tài)；5 分，死亡。

1.5 HE 染色 第16 天取EAE 組小鼠脊髓組織切片進(jìn)行HE 染色，同時(shí)取MOG 組小鼠脊髓組織進(jìn)行HE 染色，每組3 只小鼠。2%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉小鼠，待小鼠麻醉完全后，以40 g/L 多聚甲醛溶液灌注心臟處死小鼠，切取脊髓組織，固定、脫水、石蠟包埋，制備厚度不少于7 μm 的切片，行HE 染色，觀(guān)察脊髓組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘改變。

1.6 不同組織淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) EAE 組小鼠選取臨床評(píng)分2.5～4.0 分的小鼠，同時(shí)取MOG 組小鼠，每組3 只。心臟灌注處死小鼠，切取腦和脊髓組織、淋巴結(jié)（dLNs）和脾（SP），采用ACK 裂解液裂解紅細(xì)胞，密度梯度離心法，轉(zhuǎn)速1 900 r/min，離心20 min，然后輕輕吸取中間層懸狀物（勿要吸取到Percoll 分離液），置于15 ml 離心管中，加入3～4 倍體積的PBS，轉(zhuǎn)速1 700 r/min，離心5 min，倒掉上清液，加入PBS 重懸，制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，于顯微鏡下記錄T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞表型 EAE 組小鼠選取臨床評(píng)分2.5～4.0 分的小鼠，同時(shí)取MOG 組小鼠，每組4 只，首先取各組細(xì)胞計(jì)數(shù)約2×106個(gè)細(xì)胞，PBS 重懸，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，加入抗 小 鼠 CD4-FITC、CD8-PE 抗 體，CD44-APC、CD62L-PerCP，進(jìn)行染色。然后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。利用FlowJo 軟件對(duì)流式結(jié)果進(jìn)行分析，觀(guān)察小鼠脾臟及CNS 浸潤(rùn)細(xì)胞CD4、CD8、CD44、CD62L 的表達(dá)情況。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)變化在第15 天時(shí)EAE 發(fā)病高峰期選取EAE 組小鼠臨床評(píng)分2.5～4.0 分的小鼠，同時(shí)取MOG 組小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，每組4 只，然后同時(shí)提取兩組小鼠脾淋巴細(xì)胞，置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基，37℃和5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)72 h，取上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（IL-17）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用兩獨(dú)立樣本的單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE 小鼠模型誘導(dǎo)成功 在沒(méi)有注射MOG多肽的情況下，小鼠誘導(dǎo)第9 天后顯示出臨床癥狀[最高臨床評(píng)分為（3.7±0.3）分]，并且伴有嚴(yán)重的脾臟和淋巴結(jié)萎縮（見(jiàn)圖1）。C57BL/6 小鼠雙側(cè)背部皮下注射MOG35-55 多肽乳化劑免疫，尾靜脈注射PT后，EAE 小鼠病程經(jīng)歷進(jìn)展期，到達(dá)發(fā)病高峰期，出現(xiàn)典型的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)障礙的癥狀，EAE 小鼠發(fā)病高峰期脊髓組織切片HE 染色顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖2）。以上表明EAE 小鼠模型誘導(dǎo)成功。

圖1 EAE 組和MOG 組小鼠臨床評(píng)分

圖2 EAE 組和MOG 組小鼠脊髓病理切片（HE，10×40）

2.2 T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) MOG 組小鼠完全阻止了EAE 的發(fā)展和淋巴結(jié)的萎縮。SP、dLNs 及CNS 中T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)見(jiàn)表1。隨著EAE 阻止，在MOG 組中，CNS 中極少有T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，MOG 組：（1.5±0.2）×106個(gè)；EAE 組：（4.2±0.9）×106個(gè)（P＜0.01）。

表1 MOG 組和EAE 組小鼠SP、dLNs 和CNS 中T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)，±s）

表1 MOG 組和EAE 組小鼠SP、dLNs 和CNS 中T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)，±s）

2.3 脾臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)T 淋巴細(xì)胞表型流式細(xì)胞術(shù)分析 EAE 組和MOG 組CNS 浸潤(rùn)的T 淋巴細(xì)胞均由效應(yīng)T 細(xì)胞（CD44highCD62Llow）和記憶T細(xì)胞（CD44highCD62Lhigh）構(gòu)成：EAE 組CD4+細(xì)胞中CD44highCD62Llow占 71.5%，CD8+細(xì) 胞 中CD44highCD62Llow占68.2%；MOG 組CD4+細(xì) 胞 中CD44highCD62Llow占 73.4%，CD8+細(xì) 胞 中CD44highCD62Llow占66.9%。EAE 組脾臟中的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞均是CD44-細(xì)胞占大多數(shù)，其中CD4+細(xì)胞中CD44-CD62Llow占50.3%、CD44-CD62Lhigh占4.88%，CD8+細(xì)胞中CD44-CD62Llow占49.7%、CD44-CD62Lhigh占11.4%；MOG 組中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞均是CD44+細(xì)胞占大多數(shù)，其中CD4+細(xì)胞中CD44-CD62Llow占37.0%、CD44-CD62Lhigh占26.1%，CD8+細(xì) 胞 中CD44-CD62Llow占9.42% 、CD44-CD62Lhigh占47.6%。所以EAE 誘導(dǎo)之后，脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞被激活，但是只有較少的CD44highT 細(xì)胞群浸潤(rùn)到了CNS。

2.4 細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌情況ELISA 分析 ELISA 分析發(fā)現(xiàn)與EAE 組相比，MOG 組細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌均高于EAE 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α 的分泌情況ELISA 分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在第9 天EAE 組出現(xiàn)了典型的臨床癥狀，并伴有嚴(yán)重的脾臟和淋巴結(jié)萎縮，EAE 誘導(dǎo)后脾臟和dLNs 淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，在EAE 發(fā)病前10 d 達(dá)到高峰。EAE 組中，隨著EAE 小鼠周?chē)馨拖到y(tǒng)中T 細(xì)胞的減少，CNS 中T 細(xì)胞增多，尤其是CD4+T 細(xì)胞。隨著MOG 的輸注導(dǎo)致更多的T 細(xì)胞聚集在脾臟和dLNs 中，而不是CNS 中。在EAE進(jìn)展過(guò)程中，我們還觀(guān)察到在接種處偶爾出現(xiàn)了皮膚潰瘍，文獻(xiàn)報(bào)道這種形成潰瘍的小鼠經(jīng)常具有抵抗EAE 和淋巴結(jié)萎縮的能力[6]。本研究中兩組中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的 T 淋巴細(xì)胞均由效應(yīng) T 細(xì)胞（CD44highCD62Llow）和記憶T 細(xì)胞（CD44highCD62Lhigh）構(gòu)成。EAE 組脾臟中的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞均是CD44-占大多數(shù)，而MOG 組中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞均是CD44+細(xì)胞占大多數(shù)。說(shuō)明EAE 誘導(dǎo)之后，脾臟中CD4+和CD8+T 細(xì)胞被激活，但是只有較少的CD44highT 細(xì)胞群浸潤(rùn)到了CNS。綜上所述，可溶性MOG 可能是通過(guò)阻止效應(yīng)T 細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移而實(shí)現(xiàn)預(yù)防EAE 的發(fā)生和淋巴組織的萎縮。