趙錦燕 尚海霞 曾建偉 蘭煒蘭 洪振豐#

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350122）

原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析顯示原發(fā)性肝癌死亡率居全球癌癥死亡率的第四位。在我國(guó)，由于慢性肝炎和黃曲霉素污染的食物攝入使得肝癌的發(fā)病率和致死率均居高不下[1]。目前，肝癌的治療仍以綜合化療為主，然而腫瘤多藥耐藥的發(fā)生導(dǎo)致肝癌治療效果不佳[2]。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是一類普遍存在的非編碼小分子RNA，主要作用于靶基因3′非翻譯區(qū)（Untranslated Region,UTR），引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，參與調(diào)控機(jī)體的各項(xiàng)生理病理活動(dòng)（包括腫瘤）[3～5]。為探討miRNA 在肝癌耐藥中的作用，本研究應(yīng)用miRNA 表達(dá)譜芯片篩選肝癌多藥耐藥細(xì)胞異常表達(dá)的miRNA，以尋找能夠逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 Bel-7402 細(xì)胞及其5-氟尿嘧啶（5-FU）誘導(dǎo)的耐藥株Bel-7402/5-FU 購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Agilent 人miRNA 芯片19.0（博奧生物有限公司）；胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶和RPIM1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國(guó)life technologies 公司）；RNAiso for small RNA、Uni-miR qPCR Primer和SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR kit（寶生物工程大連有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Bel-7402 細(xì)胞和Bel-7402/5-FU細(xì)胞分別培養(yǎng)于RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）和含20 μg/ml 5-FU 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素），37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。檢測(cè)指標(biāo)前將Bel-7402/5-FU 細(xì)胞更換成正常的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 法驗(yàn)證Bel-7402/5-FU 的耐藥性 分別取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402 細(xì)胞和（或）Bel-7402/5-FU 細(xì)胞，以5 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔100 μl，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，分別用不同濃度的5-氟尿嘧啶（0～25 600 μM）、阿霉素（0～256 μM）、順鉑（0～128 μM）干預(yù)48 h 后用MTT法檢測(cè)，每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組的細(xì)胞活力按100%計(jì)算。

1.2.3 miRNA 表達(dá)譜分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Bel-7402 細(xì)胞和（或）Bel-7402/5-FU 細(xì)胞，分別以2.0×105/孔的密度接種于6 孔板中，每組3 個(gè)樣本，常規(guī)培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加Trizol 1 ml 提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞樣本RNA 的完整性。然后，每個(gè)樣品單獨(dú)標(biāo)記，進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)，以得到該樣品中miRNA 的表達(dá)，按照Agilent miRNA標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記后和芯片進(jìn)行雜交、清洗。使用生物芯片掃描儀掃描，獲取每個(gè)陣列熒光染料的掃描圖像和數(shù)據(jù)，并以TIFF 的文件格式保存圖像和數(shù)據(jù)。使用基因芯片提數(shù)軟件提取數(shù)據(jù)，選擇合適的數(shù)據(jù)歸一化方法，得到各個(gè)RNA 樣品的雜交信號(hào)，并選擇出差異性表達(dá)的miRNA 基因，常規(guī)篩選標(biāo)準(zhǔn)為：p-value≤5%，同時(shí)FC（abs）在2.0 倍以上。

1.2.4 RT-qPCR 驗(yàn)證 按上述方法收集細(xì)胞，應(yīng)用RNAiso for small RNA 提取miRNA，應(yīng)用SYBR PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR kit 進(jìn)行Poly（A）加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，向20 μl 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加無(wú)RNA 酶的去離子水補(bǔ)足至100 μl，取2 μl 稀釋液進(jìn)行后續(xù)的real-time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μl）：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μl，PCR Forward Primer（10 μm）0.8 μl，Uni-miR qPCR Primer（10 μm）0.8 μl，Rox Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μl，cDNA 溶液2 μl 和dH2O 6 μl。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bel-7402/5-FU 細(xì)胞具有多藥耐藥性 與Bel-7402 比較，Bel-7402/5-FU 對(duì)5-氟尿嘧啶、阿霉素和順鉑均具有耐藥性，5-氟尿嘧啶對(duì)Bel-7402 和Bel-7402/5-FU 的抑制率分別是（100.00±3.20）%、（31.41±2.34）%、（18.84±0.56）%、（15.25±0.21）%、（14.37±0.22）%、（14.22±0.21）%、（14.70±0.29）%、（13.75±0.11）%、（13.60±0.13）%、（13.93±0.23）%和（100.00±0.96）%、（100.00±0.76）%、（99.76±1.59）%、（91.75±0.88）%、（90.41±1.10）%、（85.18±1.88）%、（79.97±1.30）%、（75.66±0.76）%、（69.18±1.29）%、（67.38±1.31）%，阿霉素對(duì)Bel-7402 和Bel-7402/5-FU 的抑制率分別是（100.00±3.70）%、（82.07±2.11）%、（80.67±1.29）%、（51.34±1.38）%、（20.78±0.21）%、（22.91±0.30）%、（34.08±1.50）%、（24.41±0.24）%、（26.93±0.35）%、（28.66±0.29）%和（100.00±1.64）%、（88.37±1.06）%、（89.10±2.44）%、（87.87±1.25）%、（83.81±1.62）%、（84.39±1.82）%、（87.43±2.42）%、（79.97±1.87）%、（67.15±0.95）%、（59.62±0.43）%，順 鉑 對(duì)Bel-7402 和Bel-7402/5-FU 的抑制率分別是（100.00±4.96）%、（92.46±2.34）%、（90.28±3.75）%、（73.27±4.01）%、（63.13±4.20）%、（41.97±0.18）%、（10.41±0.11）%、（10.89±0.30）%和（100.00±2.41）%、（95.63 ±1.32）%、（96.31±2.51）%、（94.49±2.04）%、（93.30±2.29）%、（91.54±2.32）%、（90.33±1.37）%、（90.18±1.03）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 Bel-7402/5-FU 細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶、阿霉素和順鉑耐藥性

2.2 miRNA 在耐藥細(xì)胞中的差異表達(dá)譜 選擇P值≤5%，同時(shí)FC（abs）在2.0 倍以上的miRNA 做聚類分析圖和散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 有29個(gè)，其中上調(diào)14 個(gè)，下調(diào)15 個(gè)。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 miRNA 芯片檢測(cè)耐藥細(xì)胞中miRNA 的差異表達(dá)

圖3 差異表達(dá)的miRNA 柱形圖

2.3 差異表達(dá)miRNA 的驗(yàn)證 采用qPCR 驗(yàn)證miRNA 芯片中FC（abs）大于2 的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Bel-7402 細(xì)胞比較，有9 個(gè)驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果相符，其中miR-10a-5p、-371a-3p、-371a-5p、-372、-373-3p、-146a-5p、-6723-5p 下 調(diào)，miR-3148、-4497上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 miRNA 驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

腫瘤的多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥的一種交叉抗藥性，是目前肝癌治療的主要障礙[6]，克服腫瘤多藥耐藥是肝癌治療方法未來(lái)研究的重點(diǎn)。然而腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，它可能是初次使用就產(chǎn)生耐藥的原發(fā)性耐藥，也可能是用過(guò)一段時(shí)間之后產(chǎn)生的獲得性耐藥。耐藥基因mdr1/P-gp 高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外排功能增加是目前較為公認(rèn)的機(jī)制，研究者針對(duì)P-gp 的作用靶點(diǎn)研發(fā)了很多抑制劑，但由于副作用等諸多原因，很少能真正用于臨床。所以研發(fā)新型的、高效低毒的肝癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑任重而道遠(yuǎn)。

非編碼RNA 是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，隨著研究的深入，越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA 的表達(dá)能夠影響肝癌多藥耐藥[7～8]。本研究通過(guò)miRNA表達(dá)譜芯片篩選肝癌耐藥細(xì)胞株中差異表達(dá)的miRNA，并通過(guò)熒光定量PCR 驗(yàn)證，探討miRNA在肝癌耐藥中的作用。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌耐藥中，有9個(gè)miRNA 表達(dá)發(fā)生改變（miR-10a-5p、-371a-3p、-371a-5p、-372、-373-3p、-146-5p、-6723-5p 下 調(diào)，miR-4497、-3148 上調(diào)），表明在肝癌耐藥的發(fā)生中，miRNA 發(fā)揮了重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，上述miRNA 在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用（miR-371a-3p、miR-371a-5p 和miR-6723-5p 未見(jiàn)報(bào)道）。miR-10a-5p 在食道鱗癌[9]、乳腺癌[10～12]和腎細(xì)胞癌[13]中具有抑癌作用，而在顆粒癌[14]、非小細(xì)胞肺癌[15]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[16]中促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。miR-372 抑制肺癌和腎細(xì)胞癌的遷移、侵襲以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17～19]。在鼻咽癌中，miR-372 可以通過(guò)激活PBK 依賴的p53 途徑抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而增加放療的敏感性[20]；而在胃癌、肝癌和乳腺癌中，miR-372 促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程和轉(zhuǎn)移[21～23]。miR-373在膀胱癌、黑色素瘤、骨肉瘤和食道鱗癌中作為促癌miRNA 發(fā)揮作用[24～27]，而在對(duì)非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-373 能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[28～29]。miR-146 在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，在肺癌和甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮促癌作用[30～31]，在乳腺癌中則抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[32]。有關(guān)miR-3148和miR-4497 的研究較少，目前的研究發(fā)現(xiàn)miR-3148 具有促癌作用，miR-4497 具有抑癌作用[33～34]，而這些miRNA 在腫瘤多藥耐藥中的作用尚未明確，有待我們進(jìn)一步研究。miRNA 調(diào)控肝癌多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜，隨著研究的深入，我們希望能夠通過(guò)調(diào)控miRNA 成為低毒有效且不干擾抗腫瘤藥物的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。