馬 捷，李 梅*，寧莉萍*，王景燕,3，龔 偉,3，高 玥，丁 文，唐 詩(shī)

1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都611130；2四川旅游學(xué)院，成都610100；3四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum小喬木，耐寒，耐旱，不耐澇，適生于肥沃壤土和沙壤土。竹葉花椒果皮辛香，是東亞地區(qū)的傳統(tǒng)烹飪調(diào)料和中藥材原料。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》記載，其果皮及種子可溫中止痛，殺蟲(chóng)止癢。因此，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究主要集中于花椒果皮的化學(xué)成分、提取工藝[1]、生物活性[2]、貯藏條件[3]、豐產(chǎn)栽培[4]等方面，鮮見(jiàn)枝葉研究。而在生產(chǎn)實(shí)踐中，枝葉量大但不好回收利用。利用植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)原理以及竹葉花椒優(yōu)良的萌蘗能力，低海拔種植地區(qū)直接從二級(jí)分支處剪截大枝再采果，廢棄枝葉占竹葉花椒當(dāng)年?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)物質(zhì)總量的80%以上，如何進(jìn)行整株綜合利用有待研究。

精油為植物次生代謝產(chǎn)物，是具有一定氣味的揮發(fā)性油狀液體物質(zhì)，在日用化工、醫(yī)療保健、害蟲(chóng)防治、食品工業(yè)等領(lǐng)域均有著廣泛的用途[5]?；ń饭途哂锌咕鶾6]和抗氧化[7]特性，長(zhǎng)期食用可緩解冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[8]，但竹葉花椒枝和葉精油卻未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以竹葉花椒枝和葉為研究對(duì)象，通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取精油[9]，分析其化學(xué)成分和研究其抗二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)的家兔血小板聚集活性[10]，以期為高效合理和高值化利用竹葉花椒廢棄物資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

竹葉花椒枝和葉采自四川省崇州市四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)踐基地，八月份采集。日本大耳白兔購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。主要試劑有ADP和二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司；替卡格雷(Ticagrelor)，上海冠東生物科技有限公司。主要儀器有B24-29型揮發(fā)油測(cè)定儀，東莞市創(chuàng)瑞工業(yè)試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Agilent-HPGC7890型氣相色譜儀，Agilent公司；MDSMS5975型質(zhì)譜儀，Agilent公司；Chrono-log700型血小板聚集儀，Chrono-log公司。

1.2 精油提取

參考文獻(xiàn)方法[9]，準(zhǔn)確稱取竹葉花椒新鮮枝600 g、葉600 g，粉碎處理。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)，將粉料放入圓底燒瓶中，按固液比約1∶4加入蒸餾水，浸泡2小時(shí)后緩慢加熱至沸騰，保持微沸5小時(shí)后停止加熱，待裝置冷卻至室溫，收集回流冷凝裝置中的精油，用無(wú)水硫酸鈉干燥后避光保存于4 ℃環(huán)境中。

1.3 Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)檢測(cè)

正己烷以100∶1稀釋樣品。氣相色譜條件：色譜柱HP-VOC 30 m×0.25 mm×0.25 μm。升溫程序：初始溫度40 ℃保持2 min，再以5 °C/min升至180 ℃保持2 min，后以5 °C/min升至240 ℃保持8 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量10 μL，載氣為高純度氦，流速1.0 mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35～550m/z。數(shù)據(jù)處理與質(zhì)譜檢索：通過(guò)對(duì)總離子流各質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，經(jīng)軟件檢索NIST14.L譜庫(kù)，結(jié)合比對(duì)保留時(shí)間及保留指數(shù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，最終確定精油化學(xué)組成，用峰面積歸一法測(cè)算各成分的相對(duì)含量。

1.4 抗ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集活性檢測(cè)

參考文獻(xiàn)方法[10]，精油樣品加DMSO稀釋，配制成100 mg/mL溶液備用。陽(yáng)性對(duì)照Ticagrelor加 DMSO溶解，制成0.5 mg/mL溶液備用。日本大耳白兔經(jīng)耳中央動(dòng)脈抽取血液(枸櫞酸鈉真空抗凝采血管，全血∶枸櫞酸鈉為9∶1)，所得抗凝血離心(200×g,10 min)所得上清液為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)；剩余血液繼續(xù)離心(2 400×g,20 min)，所得上清液為貧血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP)，以PPP調(diào)PRP血小板計(jì)數(shù)為500×109個(gè)/L。

抑制率(%)=(空白對(duì)照組最大聚集率-樣品

組或陽(yáng)性對(duì)照組最大聚集率)/空白對(duì)照組最大聚

集率× 100%

2 結(jié)果與討論

2.1 精油提取量

竹葉花椒葉精油提取量為0.67 mL/kg，枝精油提取量為0.22 mL/kg，葉精油提取量是枝精油的3.05倍，葉精油提取量明顯高于枝精油。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)竹葉花椒葉和枝精油的研究?jī)H集中于精油成分及生物活性方面，其提取量還未有相關(guān)報(bào)道，因此本研究是首次報(bào)道竹葉花椒枝和葉精油的提取量。

2.2 精油的GC-MS分析

圖1、圖2分別為竹葉花椒枝和葉精油總離子流圖。表1為竹葉花椒枝和葉精油主要化學(xué)成分。本文采用峰面積歸一法計(jì)算化合物在精油中的相對(duì)含量，每個(gè)峰代表一個(gè)化合物，由圖1、圖2和表1比較可知，葉精油中芳樟醇的相對(duì)含量即占62.01%，所以峰明顯，其他成分相對(duì)含量較低，因此與芳樟醇比峰不明顯。枝精油多峰明顯突出，是因?yàn)橹饕煞址植驾^分散。葉精油主要集中于10到30分鐘區(qū)間出峰，而枝精油在30分鐘到45分鐘出峰密集，說(shuō)明枝精油較葉精油含有更多熔沸點(diǎn)較高、分子量較大、分子結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的化合物。

圖1 竹葉花椒枝精油總離子圖Fig.1 The total ion chromatogram of essential oilsfrom branches of Zanthoxylum armatum DC.

圖2 竹葉花椒葉精油總離子圖Fig.2 The total ion chromatogram of essential oils from leaves of Zanthoxylum armatum DC.

枝精油鑒定出48種化學(xué)成分，占化合物總量的96.59%；葉精油鑒定出45種，占化合物總量的99.92%。枝精油主要化學(xué)成分有2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亞麻醇5.32%，芳樟醇5.21%。葉精油主要化學(xué)成分有芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-檸檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-對(duì)孟二烯2.27%。二者共同共有16種化學(xué)成分，分別占竹葉花椒枝精油和葉精油總含量的52.51%和87.6%。目前關(guān)于竹葉花椒葉精油成分的報(bào)道均來(lái)自印度學(xué)者。印度竹葉花椒葉精油主要成分為2-十一酮44.58%，芳樟醇14.53%，2-十三酮7.98%[11]。與本研究測(cè)得的中國(guó)竹葉花椒葉精油主要成分相似，都含有芳樟醇，2-十一酮，2-十三酮且含量明顯高于其他化合物。但它們各自在總量中的相對(duì)含量具有較大差異，應(yīng)該是受到了不同地理環(huán)境、氣候和生境的影響。云南西雙版納產(chǎn)竹葉花椒枝精油主要成分為茴香烯20.5%，1,8-桉葉素14%，2-十三酮12.5%[12]，盡管與本研究中枝主要成分有一定差異，但都含有2-十三酮。竹葉花椒果精油主要成分為芳樟醇56.77%，D-檸檬烯18.97%，β-水芹烯11.98%[13]，其與竹葉花椒葉精油的主要成分相似度較枝精油高，這與葉的光合作用最為活躍，其次生代謝產(chǎn)生的大量化合物就近運(yùn)輸至果實(shí)有關(guān)。

竹葉花椒枝和葉精油開(kāi)發(fā)前景十分廣闊。竹葉花椒葉精油對(duì)大鼠爪水腫情況有顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎作用[11]，可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌的細(xì)胞活性[14]。其中主要化合物芳樟醇有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性[15]；β-石竹烯有抗炎、抗癌、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)和防治肝損傷等作用[16]；D-檸檬烯可防治糖脂代謝紊亂、抗炎、抑菌、抗癌[17]。此外，芳樟醇有鈴蘭香，β-石竹烯有柑橘香，D-檸檬烯有檸檬香，2-十三酮有奶香和藥草樣，2-十一酮有玫瑰香、奶酪香以及椰香，均為生產(chǎn)中常用的食用香精和香料。因此竹葉花椒枝和葉可作為開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)香料、食用香精及醫(yī)藥保健品的原料選擇。在預(yù)防心腦血管疾病方面，芹菜籽油能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集[18]，而芹菜籽油中的典型活性成分D-檸檬烯、芳樟醇、β-石竹烯竹[19]與竹葉花枝和葉精油相同，因此下文將對(duì)竹葉花椒枝和葉精油對(duì)ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集的影響進(jìn)行研究，以期為竹葉花椒枝和葉的高值化利用提供參考。

2.3 抗ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集活性測(cè)定

城市化生活導(dǎo)致高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心腦血管疾病患者驟增的同時(shí)，亦使這一群體對(duì)此類醫(yī)療保健的需求上漲。由于治療心腦血管疾病的藥物普遍價(jià)格較高，多數(shù)非洲和亞洲發(fā)展中國(guó)家的慢性病患者正轉(zhuǎn)向國(guó)家衛(wèi)生部推薦的植物類藥物作為替代治療來(lái)源。已有研究表明花椒果精油可減輕冠狀動(dòng)脈狹窄程度，為心腦血管疾病患病的保護(hù)因素[8]。竹葉花椒果精油主要成分為芳樟醇，D-檸檬烯，β-水芹烯，β-石竹烯，而竹葉花椒枝和葉精油均含有大量的芳樟醇、D-檸檬和β-石竹烯。相似的成分可能導(dǎo)致相似的生物活性。竹葉花椒枝和葉作為廢棄物，量大且?guī)缀趿愠杀?，目前采用的焚燒還田的做法不僅浪費(fèi)碳匯資源而且污染環(huán)境。如果能從竹葉花椒枝和葉中提取出對(duì)心腦血管疾病具有療效的成分，不僅可以高效利用廢棄資源，而且有可能顯著降低此類藥物的成本。

表1 竹葉花椒枝和葉精油主要化學(xué)成分

續(xù)表2(Continued Tab.2)

峰號(hào)No.保留時(shí)間tR(min)化合物Compound含量Content(%)枝Branch葉Leaf3925.882-十七醇2-Heptadecanol0.504026.88欖香素Elemicin0.124127.23橙花叔醇2 Nerolidol 20.290.934227.72桉油烯醇Spathulenol0.200.144327.86氧化石竹烯Caryophyllene oxide1.930.364428.5(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-四甲基-12-氧雜環(huán)[9.1.0]十二烷-3,7-二烯(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-Tetramethyl-12-oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene0.534528.67癸氫-3,3,4,7a-四甲基-1H-環(huán)戊烷[a]戊-7-醇乙酸酯Decahydro-3,3,4,7a-tetramethyl-1H-cyclopenta[a]pentalen-7-ol acetate0.144629.52α-畢橙茄醇α-Cadinol0.504729.52綠花白千層醇Himbacco0.234830月桂酸乙烯酯Vinyllaurate0.134930.362-十五酮2-Pentadecanone0.225030.79正十五碳醛Pentadecanal0.625130.7911-乙酸十二烯酯11-Dodecenyl acetate0.215232.949-十六碳烯醛9-Hexadecenal0.215333.5十六醛Hexadecanal0.965434.084-硝基苯基月桂酸酯4-Nitrophenyllaurate2.665535.12環(huán)十六烷Cyclohexadecane0.215635.5213-十八碳烯醛13-Octadecenal0.375737.039-十八烯醇9-Octadecen-1-ol0.205837.1813-異海松二烯13-Isopimaradiene4.545937.659,17-十八碳二烯醛9,17-Octadecadienal4.120.146037.78亞麻酸Linolenic acid3.866137.87 2,13-十八烷二烯-1-醇2,13-Octadecadien-1-ol0.166237.979-十八烯醛9-Octadecenal11.576338.34十八醛Octadecanal0.636439.03亞麻醇Linoleic alcohol5.326539.18油醇9-Octadecen-1-ol1.820.186639.58(7Z,10Z,13Z)-7,10,13-十六碳三烯醛 (7Z,10Z,13Z)-7,10,13-Hexadecatrienal0.216739.691-十八烯1-Octadecene2.026840.18葉綠醇Phytol3.980.606940.59角鯊烯Supraene1.767040.761-甲基環(huán)癸烯 1-Methyl-cyclodecene,0.507141.002,4-十二碳二烯?；惗□０?,4-Dodecadienoyl isobutylamide1.437241.409-十八烯酰2-[(Z)-9-Octadecenyloxy?ethanol0.437341.56亞麻酸乙酯Ethyl linolenate0.587442.712,6,10,14-十六烷-1-醇,3,7,11,15-四甲基2,6,10,14- Hexadecatetraen-1-ol,3,7,11,15-tetramethyl1.707544.50環(huán)戊烷-1,3-二甲酸甲酯Dimethylester-1,3-cyclopentanedicarboxylicacid0.727644.84油酸酰胺Oleamide0.267747.64二十烷Eicosane0.23總計(jì)Total(%)96.5999.92共同共有成分合計(jì)Total common components(%)52.5187.60

血小板是凝血機(jī)制的重要成分，不僅構(gòu)成血小板-纖維蛋白栓子(Platelet-fibrin thrombi)，同時(shí)參與動(dòng)脈粥樣硬化斑的形成，因此抑制血小板聚集是治療多種心腦血管疾病的重要手段之一。表2為竹葉花椒枝和葉精油對(duì)ADP誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響。由表可知1 mg/mL濃度下，竹葉花椒枝和葉精油對(duì)血小板聚集均有一定的抑制作用，葉精油抑制率為67.4%±24.0%，枝精油抑制率為14.3%±14.6%，葉精油的抑制率約是枝精油的4.7倍，因此葉精油的抑制效果顯著優(yōu)于枝精油。葉精油與空白對(duì)照相比P< 0.01，差異顯著；枝精油與空白對(duì)照相比P> 0.05，差異不顯著；陽(yáng)性對(duì)照Ticagrelor與空白對(duì)照相比P< 0.001，差異非常顯著。上述結(jié)果顯示竹葉花椒葉精油抗血小板聚集效果稍弱于Ticagrelor，此系精油作為天然混合物，其中的有效物質(zhì)含量明顯低于成熟的純品藥物所致。與常規(guī)抗凝藥物Ticagrelor的高成本、高價(jià)格以及可導(dǎo)致心臟停搏、痛風(fēng)和腎臟損害等多種嚴(yán)重副作用相比[20]，竹葉花椒葉優(yōu)勢(shì)明顯。其屬于廢棄物，量大且?guī)缀趿愠杀?，精油成分主要為芳樟醇?-十一酮，2-十三酮，D-檸檬烯等食品香精原料，毒性低，因此其開(kāi)發(fā)為天然低成本心血管系統(tǒng)疾病藥物以及保健日化產(chǎn)品的巨大潛力值得關(guān)注。

表2 竹葉花椒枝和葉精油對(duì)ADP誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響

注：與空白對(duì)照比較，**P< 0.01；***P< 0.001.

Note:Compared with the control,**P< 0.01;***P< 0.001.

3 結(jié)論

竹葉花椒葉精油提取量為0.67 mL/kg，枝精油提取量為0.22 mL/kg，葉精油提取量高于枝精油。

竹葉花椒枝精油鑒定出48種化學(xué)成分，占化合物總量的96.59%，主要化學(xué)成分為2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亞麻醇5.32%，芳樟醇5.21%；葉精油鑒定出45種化學(xué)成分，占化合物總量的99.92%，主要化學(xué)成分為芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-檸檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-對(duì)孟二烯2.27%。竹葉花椒枝和葉精油共同共有16種化學(xué)成分，分別占總含量的52.51%和87.6%。由于竹葉花椒枝和葉精油主要化學(xué)成分相似度較高，加之原材料易得，成本低廉，生產(chǎn)實(shí)踐中可考慮混合提取，作為開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)香料、食用香精及醫(yī)藥保健品的原料選擇。

竹葉花椒枝精油對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的抑制率為14.3%±14.6%，葉精油的抑制率為67.4%±24%，葉精油抑制效果顯著優(yōu)于枝精油。竹葉花椒葉有開(kāi)發(fā)為天然低成本心血管系統(tǒng)疾病藥物或相關(guān)產(chǎn)品的潛力。